酵母双杂交筛选心脏cDNA文库中与人热激蛋白70相互作用的蛋白质

目的:利用酵母双杂交系统从人心肌cDNA文库中筛选与热激蛋白70(HSP70)相互作用的蛋白质。方法:从人心脏cDNA文库扩增Hsp70基因,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-Hsp70酵母细胞AH109中的自激活活性;将构建的酵母表达诱饵质粒载体pGBKT7-Hsp70转化AH109酵母细胞,与转化有人心脏cDNA文库的酵母Yl87进行交配实验,筛选与HSP70相互作用的蛋白质,通过一对一的回复杂交实验排除假阳性,对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:构建了"诱饵"质粒栽体pGBKT7-Hsp70,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活活性,筛选得到多个与Hsp70相互作用的阳性转化子,并最终得到HSP70的1个相互作用蛋白质HIP。结论:应用酵母双杂交系统筛选出与HSP70相互作用的1个蛋白质,它们的相互作用可能与HSP70发挥细胞分子伴侣作用有关。

高温胁迫下B型烟粉虱热激蛋白基因hsp70表达量的变化

为了探讨热激蛋白在B型烟粉虱Bemisiatabaci B-biotype抵抗高温中的作用,以含有B型烟粉虱热激蛋白基因hsp70片段的质粒为模板,用TaqMan-MGB探针和特异性引物构建了B型烟粉虱hsp70实时荧光定量RT-PCR检测体系,并检测了37℃-45℃高温胁迫及气温变化时B型烟粉虱成虫体内hsp70表达的情况。结果表明：缓和的高温对B型烟粉虱成虫hsp70表达具有诱导作用,在37℃-41℃范围内,hsp70的表达量随着温度的升高从8.78×10^5±6.41×10^4拷贝数上升到1.99×10^7±1.45×10^5拷贝数,在41℃时达到最高峰;而当温度升高到43℃和45℃,hsp70表达量迅速降低。B型烟粉虱成虫hsp70的表达与昼夜气温变化有关,当上午气温从34℃上升到41℃时,hsp70的表达量从1.16×10^5±1.48×10^4拷贝数上升到6.29×10^6±1.80×10^5拷贝数;当傍晚气温下降到33℃时,hsp70表达量也下降到2.32×10^5±7.69×10^3拷贝数。因此推测,hsp70在B型烟粉虱抵抗高温胁迫方面可能具有重要作用。

朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因TCHSP70-4的克隆与表达

为了研究朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)热激蛋白HSP70的表达与其适应高温和低温胁迫的关系,我们利用物种的同源性及RACE技术,获得朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因1个,命名为TCHSP70-4(GenBank登录号为EU977182)。该基因全长2182bp,包含1959bp的开放阅读框,编码653个氨基酸,理论分子量为70.9kDa,等电点为5.4,含有HSP70家族高度保守的基序。运用real-time PCR分析冷激(4℃)和热激(40℃)1h后TCHSP70-4在朱砂叶螨体内的表达量。结果显示冷激后TCHSP70-4表达量明显下降,而热激后TCHSP70-4表达量却明显上升。这些结果一方面表明该基因属于诱导型HSP70基因,另一方面揭示了朱砂叶螨分别受到冷和热胁迫后体内TCHSP70-4的表达及所起的保护作用是不同的。

热激蛋白HSP70在肿瘤免疫反应中作用的研究进展

热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)是细胞受应激原刺激后诱导产生的一组应激蛋白,在进化上高度保守。热激蛋白的功能有很多,充当分子伴侣,参与蛋白质折叠和转运。最近研究表明HSP70还在肿瘤免疫反应过程中起协同作用,充当呈递载体,将抗原肽呈递于APC表面引起CTL毒性杀死感染细胞和肿瘤细胞。在肿瘤的免疫治疗中作为免疫疫苗的载体有很好的前景。

大鼠弥漫性轴索损伤后海马热休克蛋白质70 mRNA表达

目的研究大鼠弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)后大脑海马中热休克蛋白质(heat-shockproteins,HSP)70 mRNA的表达变化。方法采用RT-PCR扩增,扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检验,观察DAI后大鼠海马中HSP70 mRNA的表达变化。结果损伤后4 h,大鼠海马中HSP70 mRNA的表达增加,24 h表达达高峰,48 h后表达减弱。结论大鼠海马中HSP70 mRNA表达可作为DAI诊断的参考指标。

拟南芥热激蛋白HSP70基因片段克隆实验体系的建立

以拟南芥为材料,对热激蛋白HSP70基因片段进行了克隆研究,获得了最佳的分子克隆实验体系.首先提取拟南芥总DNA,接着在热激蛋白HSP70编码区设计引物,扩增出HSP70编码区的片断,再将HSP70编码区的片断加上具有EcoR I酶切位点双链的人工接头,通过EcoR I对其进行酶切.再与经过EcoR I酶切并已经去磷酸化的PUC19载体通过T4连接酶进行连接,然后将连接产物置入到感受态大肠杆菌细胞中(即转化),并让这种细胞在含有Amp+/IPTG/X-Gal的LB培养基上生长.挑取培养基上蓝白斑中的白斑,进行质粒DNA提取,通过酶切质粒DNA,从而初步判断目的片段已被克隆.

斑玉蕈热激蛋白基因hsp70在刺芹侧耳中的转化

将斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus)热激蛋白基因hsp70通过农杆菌介导的方法对刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)进行遗传转化,PCR验证得到刺芹侧耳抗性转化子。试验表明:潮霉素浓度为70μg/mL,乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L,侵染时间为90 min,共培养时间为2 d时转化率最高。

紫茎泽兰热激蛋白70基因的克隆与序列分析

热激蛋白70(HSP70)与植物的抗逆性密切相关。根据其他植物hsp70的保守性区域设计特异性引物,采用RT-PCR方法从紫茎泽兰Ageratina adenophora中克隆到hsp70基因全长cDNA序列。序列分析结果表明,该cDNA包含1个1 938 bp的开放阅读框(GenBank登录号:FJ598132),共编码645个氨基酸,相对分子质量为70.58 kDa,命名为hsp70.58。该蛋白包含真核生物HSP70高度保守的三个家族标签和末尾基序EEVD。运用实时定量PCR分析,探测到hsp70.58在mRNA水平上皆能被高温和低温诱导表达,说明该基因属于诱导型hsp70基因。

钙调素通过HSP70调控热激转录因子的活性

凝胶阻滞分析结果显示,70kD的热激蛋白(HSP70)抑制热激转录因子(HSF)的DNA结合活性;利用免疫共沉淀法在细胞提取液中检测到了CaMHSP70复合物的存在,并且热激后CaMHSP70复合物含量增加.表明钙调素(CaM)调控HSF活性可能是通过与HSP70结合起作用.

谢氏宽漠王HSP70基因cDNA片段的克隆及热激条件下的表达

谢氏宽漠王Mantichorula semenowi Reitter是一种沙漠指示性甲虫。本研究由该种甲虫体内克隆到两种不同的HSP70基因片段,分别为MsHSP70和MsHSC70。同源性发现表明这两个基因片段与已报道的其他昆虫的热休克蛋白核苷酸序列高度同源。半定量RT-PCR分析显示：经42℃热激1h后立即诱导MsHSP70表达至最高峰;在恢复到室温的1～4h内MsHSP70表达量逐渐降低,但仍然高于未热激对照组。而MsHSC70在42℃热激1h后表达受到抑制,但在恢复2h和4h时有少量的表达,分别仅为未热激对照组的0.25和0.28倍。结果提示MsHSP70和MsHSC70在保护细胞方面具有不同的作用。本实验结果为谢氏宽漠王在极端的沙漠环境胁迫下的抗逆适应性研究提供了理论基础。

叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-3701基因的克隆及高温胁迫下的表达分析

为探讨热激蛋白Hsp70基因在高温胁迫下的响应机制及其分子机理，分析Hsp70基因与叶用莴苣耐热性的关系，该研究通过同源克隆及RACE技术，克隆了叶用莴苣热激蛋白LsHsp70—3701基因的cDNA全长序列，利用实时荧光定量PCR（qRTPCR）分析该基因在叶用莴苣热敏品种P-S11和耐热品种G-S59中高温胁迫下的表达差异。

热休克蛋白70在CO_2激光照射豚鼠耳蜗中表达的实验学研究

目的探讨CO2激光照射豚鼠耳蜗后热休克蛋白70(Hsp70)表达的改变、耳蜗超微结构改变与听功能的变化三者之间的关系。方法36只红目豚鼠分3组,分别以功率为1、2和3W的CO2激光在豚鼠左耳耳蜗底周打孔,听性脑干诱发电检查听功能变化,扫描电镜技术观察耳蜗形态学变化,SABC免疫组化技术及图像分析技术,观察耳蜗Hsp70表达的情况。结果术后即刻3组听阈较术前明显升高,照射后3周1W组听阈基本恢复,2W和3W组听阈有所下降但仍高于术前;术后3周,扫描电镜观察1W组外毛细胞静纤毛个别紊乱,2W组出现散在的外毛细胞静纤毛的倒伏,排列紊乱,3W组出现外毛细胞静纤毛严重缺失、破坏和融合呈球状;术后即刻3组耳蜗中Corti器和螺旋神经节Hsp70表达较对照组明显增强,术后3周1W组Hsp70表达与对照组无明显差异,2W和3W组Hsp70表达较对照组有所增强,且A和B组术后即刻和术后3周、C组术后即刻ABR阈值的变化和Hsp70阳性反应平均灰度值的变化密切相关,而C组术后3周ABR阈值的变化和Hsp70阳性反应平均灰度值的变化无明显相关。结论CO2激光照射豚鼠耳蜗后能诱发耳蜗热休克反应,使HSP70表达增强,其表达程度与听功能的变化、耳蜗超微结构损伤密切有关。

非小细胞肺癌组织中热休克蛋白HSP70的表达及意义

目的:研究非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者癌组织的热休克蛋白(heat shock protein, HSP)的表达及病理学意义.方法:通过免疫组化的方法研究HSP70在NSCLC组织中的表达,分析其与NSCLC组织分型、分化程度及临床分期的关系.结果:47例NSCLC组织中37 例HSP70表达阳性,较癌旁组织明显增加,P<0.01;26例鳞癌中20例为阳性表达,21例腺癌中17例阳性表达,P>0.05; 16例高分化癌中有10例阳性表达,31例中低分化癌中27例表达阳性,P<0.05;20例Ⅰ～Ⅱ期癌中有13例阳性表达,27例Ⅲ～Ⅳ期癌中24例表达阳性,P<0.05;30例伴有淋巴结转移的NSCLC中有27例阳性表达,17例不伴有淋巴结转移的NSCLC中10例表达阳性,P<0.05.NSCLC组织HSP70表达显著升高,HSP70表达与NSCLC的临床分期相关,但与NSCLC组织类型无关.结论:HSP70在NSCLC的发展与演进中可能具有重要的意义.

稀有鲫热激蛋白70的分子克隆及表达特征分析（英文）

为研究稀有逗鲫(Gobiocypris rarus)HSP70用于淡水毒理学和风险评估方面的可行性,通过cDNA末端快速扩增的方法首次从稀有逗鲫肝脏中成功克隆出HSP70基因的cDNA全长,命名为GrHSP70。NCBI比对分析结果显示,GrHSP70核苷酸序列与其他鱼类的HSP70基因的核苷酸序列相似性极高,相应的氨基酸序列同源性也高(大于95%)。通过实时定量PCR获得未经污染物暴露的稀有逗鲫幼鱼体内13种组织中GrHSP70的分布以及PCP暴露后肝脏中该基因的表达图谱,结果表明GrHSP70在稀有逗鲫体内的表达呈现出组织依赖性,在性腺组织中的表达最高。此外,在不同时间﹑不同浓度的PCP暴露下稀有逗鲫肝脏中GrHSP70的表达模式呈现出显著的时间-剂量依赖效应。总之,GrHSP70可作为一种非常敏感的生物标志物,适用于中国淡水环境污染的毒理学研究及风险评估。

白菜型冬油菜响应干旱胁迫差异蛋白质组学和HSC70-1基因克隆及表达分析

为探索白菜型冬油菜抗旱机理,采用双向电泳结合液相色谱-质谱技术分析抗旱冬油菜品系DR-5差异蛋白质组变化,克隆其差异蛋白热激同源蛋白70(heat shock cognate protein 70)基因HSC70-1,研究干旱胁迫对白菜型冬油菜HSC70-1表达的影响。质谱鉴定出23个差异蛋白质,分别参与刺激响应(5)、糖/能量代谢(6)、脂代谢(2)、信号转导(1)、氨基酸/蛋白质代谢(2)、核酸代谢(1)、细胞骨架(1)、光合作用(2)、伴侣蛋白(3)。同源克隆得到1 911bp的HSC70-1基因完整开放阅读框,编码637个氨基酸残基。所编码的蛋白HSC70是稳定的疏水性蛋白质,含有HSP蛋白家族特有的核酸结合功能区及底物结合功能区,有5个活性口袋,氨基酸序列与白菜型油菜(Brassica rapa)HSC70氨基酸序列相似度达98%。实时荧光定量和半定量分析HSC70-1基因干旱胁迫下表达,发现HSC70-1在叶片中上调表达。本研究结果为冬油菜抗旱育种提供了理论基础。

热休克蛋白70对中暑大鼠急性肺损伤的保护作用及机制研究

目的观察热休克蛋白70(HSP70)对急性肺损伤的保护作用。方法 64只SD大鼠按随机数字表法分为假加热正常对照组(Sham组)、中暑组(HS组)、中暑加谷氨酰胺处理组(HS+GLN组)和中暑加槲皮素处理组(HS+QU组),每组16只。Sham组大鼠置于温度23℃,湿度55%±5%环境中,其余3组大鼠置于模拟热气候动物舱(舱内温度39℃,相对湿度65%)内。监测大鼠直肠温度、收缩压和脉率,比较各组大鼠热应激反应的差异。以收缩压从峰值开始下降作为中暑的开始,之后将大鼠移至常温复温。分别在中暑恢复期0h和6h处死大鼠,每个时间点8只,留取支气管肺泡灌洗液(BALF)后分离肺脏组织行组织学观察。采用酶联免疫法检测BALF中的IL-1β、TNF-α和IL-6浓度,以及肺组织匀浆中的HSP70浓度。结果与HS组和HS+QU大鼠比较,HS+GLN组大鼠承受更多的热负荷后才发生HS(P<0.001),起病后的中位生存时间明显延长(P<0.001)。与Sham组比较,HS组大鼠肺组织匀浆HSP70浓度呈时间依赖性升高(P<0.001);HS+GLN组HSP70浓度在各个时点与HS组比较均明显升高(P<0.001),而HS+QU组的HSP70表达则受到明显抑制时点与Sham组比较差异无统计学意义(P>0.05),但明显低于HS组和HS+GLN组(P<0.001)。与HS组和HS+QU组比较,HS+GLN组大鼠BALF中的IL-1β、TNF-α和IL-6浓度明显降低(P<0.001),病理结果显示其肺损伤更轻(P<0.001),而HS+QU组则相反。结论 HSP70具有保护HS大鼠急性肺损伤的作用,其机制可能与增强大鼠热耐受能力和抑制HS大鼠肺部炎症相关。

热休克及菌胁迫对厚壳贻贝HSP70基因表达的影响

70 ku的热激蛋白(HSP70)具有细胞内分子伴侣和细胞外免疫调节功能,是受到热激、重金属、干旱、疾病、寄生虫感染等条件胁迫后产生的诱导蛋白。本实验利用同源克隆法,获得厚壳贻贝HSP70基因1 700 bp的核心序列,BLAST比对和系统进化分析显示,该序列与已知的双壳贝类相应分子高度同源,其中与紫贻贝HSP70基因相似性高达96%,在进化树中两者位于同一分支。37℃热激后,厚壳贻贝肝胰腺和鳃中HSP70基因的表达快速上调,2 h即达到对照组30倍,随后持续上升,肝胰腺中最高表达量达到对照组100倍,说明厚壳贻贝HSP70分子为典型的热诱导蛋白。鉴于大肠杆菌及枯草芽孢杆菌是水体中常见微生物,进一步利用实时荧光定量PCR技术检测上述两种细菌感染后,HSP70基因在厚壳贻贝鳃和肝胰腺中的表达水平,结果显示,两种细菌均可引起厚壳贻贝鳃和肝胰腺的HSP70基因表达上升,但大肠杆菌诱导效应显著,8 h时表达量达到最高,鳃为对照组的4倍,肝胰腺为4.5倍,随后逐渐下降,到48 h已恢复到原始水平;枯草芽孢杆菌刺激后,肝胰腺组织中最高表达量在刺激后6 h约为对照组2.5倍,与注射PBS的效果相差不大,鳃组织的响应较肝胰腺组织明显,表达量缓慢升高,8 h达到最高,为对照组4倍,随后迅速下降,直至生理水平。研究表明,厚壳贻贝HSP70分子在调节环境胁迫及宿主免疫防御中具有重要功能。

重组蛋白PSCA-HSP70的免疫活性及抗肿瘤效应观察

目的探讨重组前列腺干细胞抗原(PSCA)-热休克蛋白70(HSP70)融合蛋白对前列腺肿瘤模型小鼠的免疫激活作用及抗肿瘤活性。方法健康雄性C57BL/6小鼠25只,随机均分为PSCA组、HSP组、PSCA+HSP组、PSCAHSP组及PBS组(n=5)。小鼠皮下注射1×106个前列腺肿瘤细胞(RM-PSCA/Luc细胞),3d后分别采用相应重组蛋白进行免疫(100μg/只),2周后采用相同剂量加强免疫1次,观察肿瘤生长及小鼠存活状况。加强免疫后10d处死动物,采用ELISPOT法和流式细胞术检测PSCA特异性T细胞反应,ELISA法检测PSCA特异性抗体水平。结果 ELISPOT法检测显示,PSCA-HSP组分泌IFN-γ的CD8+T细胞数明显高于其他各组(P<0.05);流式细胞术检测结果显示,PSCA-HSP组CD8+/IFN-γ+T细胞数明显高于其他各组(P<0.05);ELISA检测显示,PSCA、PSCA+HSP、PSCA-HSP均可诱导产生PSCA特异的体液免疫反应,且3组间抗体水平差异无统计学意义(P>0.05)。PSCA-HSP组肿瘤体积明显小于其余各组,小鼠存活时间明显长于其余各组(P<0.05)。结论 HSP70是一种效应显著的分子伴侣,重组PSCA-HSP70融合蛋白在前列腺癌的治疗中具有重要的潜在应用价值。

热激蛋白的分子进化研究

热激蛋白是细胞内含量最丰富的蛋白质之一,在各种生物体内广泛分布.近年来对热激蛋白的研究已深入到结构、性质、功能等各面,其研究主要集中在:1)作为分子伴侣协助细胞内肽链的折叠;2)参与MHCⅠ类的分子呈递;3)使抗原通过内吞作用进入靶细胞;4)肿瘤免疫和分子疫苗开发.然而,虽然热激蛋白的研究已成为医学、生物学上的热点,其在分子进化上的研究也日渐增多,但这方面的报道仍然较少,本文主要从热激蛋白分子进化方面作一综述,这对理论研究、生物进化分析上都有着重要的意义.