过表达HSPC238对Bel7402细胞周期的影响

目的:构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,研究过表达HSPC238基因对人肝癌细胞株Bel7402细胞周期的影响。方法:采用PCR法从pET28b/HSPC238重组质粒中克隆得到HSPC238 cDNA全长序列,并将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染Bel7402细胞,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株。用RT-PCR和Western blot技术分别检测HSPC238基因在Bel7402中的mRNA和蛋白水平的表达。随后用饥饿法使各组细胞周期同步化,再用流式细胞仪分析HSPC238过表达对细胞周期的影响。结果:pcDNA3.1(-)/HSPC238经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因HSPC238的序列完全正确;RT-PCR和Western blot检测显示,与转染pcDNA3.1(-)组和未转染组相比较,转染pcDNA3.1(-)/HSPC238组的mRNA和蛋白表达水平均明显增高,但前两者间没有差异。用饥饿法同步化后,流式细胞仪检测显示过表达HSPC238可延缓Bel7402细胞株从G1期进入S期。结论:成功构建了pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,并在Bel7402中表达。初步发现过表达HSPC238可延缓肝癌细胞的细胞周期,为更进一步研究HSPC238蛋白的功能奠定了基础。

HSPC238对HMOX1、RPS27a、MT2A、UBB调节的初步研究

目的:探讨HSPC238过表达或低表达对目标蛋白(HMOX1、MT2A、UBB、RPS27a)的调节作用及其调节途径。方法:分别构建HSPC238的干扰载体及高表达载体,脂质体法转染HEPG2细胞株,RT-PCR、Western blot检测HSPC238及目标蛋白的mRNA、蛋白的表达量;进一步用目标蛋白的高表达质粒分别转染低表达及高表达HSPC238的HEPG2细胞株,实验组另以蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,镍柱纯化目标蛋白,以HSPC238做免疫印迹,检测目标蛋白累积情况。结果:外源性干扰HSPC238后HMOX1、MT2A、RPS27a表达下调较明显,外源性过表达HSPC238后MT2A、UBB、RPS27a表达水平明显上调;目标蛋白的高表达质粒分别转染低表达及高表达HSPC238的HEPG2细胞株,实验组以蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,与对照组比较,泛素化的目标蛋白条带明显增加。结论:过表达HSPC238可上调MT2A、UBB、RPS27a的表达,干扰HSPC238可下调HMOX1、MT2A、RPS27a的表达;HSPC238可能通过泛素蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome pathway,UPP)对目标蛋白发挥调节作用。

HSPC238对肝癌细胞中RB基因表达的影响

目的观察HSPC238对肝癌细胞中RB mRNA和pRb蛋白水平的影响。方法将PcDNA3.1-HSPC238质粒和PLL3.7-HSPC238干扰载体分别转染HepG2细胞,用实时荧光定量PCR的方法检测RB mRNA的表达量;采用Western blotting法检测pRb蛋白的表达。结果和对照组相比,转染高表达HSPC238载体时,HepG2细胞中RB的mRNA水平和pRb表达量也增加;相反地,和对照组相比,转染低表达HSPC238载体时,HepG2细胞中RB的mRNA水平和pRb蛋白的表达量也减少。以上结果差异均有统计学意义(P<0.05)。结论在HepG2细胞中HSPC238对RB基因的表达存在正向调控作用。

抗HSPC238单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的制备抗HSPC238的单克隆抗体,为HSPC238的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白HSPC238为抗原,免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备HSPC238单克隆抗体,并用间接ELISA法和Western-blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立两株稳定分泌抗HSPC238的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为E001和E002。ELISA检测抗HSPC238单克隆抗体的腹水效价为1∶12800和1∶25600。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。通过Western-blot实验证实,两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性HSPC238蛋白。结论成功制备了两株效价高、特异性好的抗HSPC238单克隆抗体,制备的抗HSPC238单克隆抗体可用于HSPC238蛋白的鉴定,为HSPC238蛋白的生物学功能研究奠定了基础。

HSPC238相互作用蛋白RPL5的初步筛选

目的:构建HSPC238诱饵载体,筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。方法:基因合成法合成HSPC238基因,sfi IA和sfi IB双酶切后与pGBKT7诱饵载体连接,获得诱饵质粒pGBKT7-HSPC238,经测序鉴定后与酵母双杂交空质粒pGBKT7共同转化到酵母菌株AH109,在营养缺陷培养基中观察pGBKT7-HSPC238的自激活作用,进一步从人胎肝c DNA文库中筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。结果:诱饵载体pGBKT7-HSPC238构建成功,经表型筛选检测无自激活作用,经酵母双杂交技术结合文献分析,从人胎肝c DNA文库中初步筛选发现核糖体蛋白L5(Ribosomal protein L5,RPL5)可能是HSPC238相互作用的目标蛋白之一。结论:成功构建pGBKT7-HSPC238诱饵质粒载体,且经酵母双杂交技术结合文献分析发现RPL5可能是与HSPC238相互作用的目标蛋白之一。

膀胱癌组织中HSPC238的表达及其临床意义

目的:检测膀胱癌患者肿瘤组织中HSPC238的改变,并探讨其相关的临床意义。方法:取海南省人民医院2016年1月至2017年7月收治的膀胱癌116例,取癌旁非肿瘤组织作为对照。使用荧光定量PCR检测HSPC238基因的表达。结果:膀胱癌组织中HSPC238为0.172±0.023,显著低于对照膀胱组织的0.304±0.051(P<0.01)。HSPC238在TNM临床III,IV期患者为0.137±0.017,显著低于I,II期患者的0.194±0.028(P<0.01)。HSPC238在浸润深度达到肌层的患者为0.161±0.021,显著低于未达到肌层的0.195±0.029(P<0.05)。HSPC238在中、低分化患者为0.156±0.021,显著低于高分化的0.205±0.037(P<0.05)。HSPC238在淋巴结有转移患者为0.147±0.016,显著低于无转移的0.181±0.022(P<0.05)。结论:膀胱癌组织中HSPC238基因低表达,其表达变化可能参与膀胱癌的发生、发展、侵袭和转移。

HSPC238在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达与意义

目的:检测HSPC238在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达。方法:收集76例宫颈癌、105例CIN及28例正常宫颈标本,采用免疫组织化学的方法检测HSPC238的表达,比较不同组织中HSPC238表达的差异。结果:正常组织和癌组织中的HSPC238的表达强度无显著差异(Z=-0.242,P>0.05)宫颈上皮内瘤变组织(CINⅠ,CINⅡ,CINⅢ)与正常组织有显著差异(χ2=19.159,P<0.01),并且发现HSPC238的表达与CIN的分级存在显著相关性,随着CIN级别升高,染色程度降低(rs=-0.327,P<0.01)。结论:HSPC238的低表达与宫颈肿瘤的发生发展可能有一定关系。

干扰HSPC238对宫颈癌Hela细胞裸鼠成瘤的促进作用

目的观察干扰HSPC238对宫颈癌Hela细胞裸鼠成瘤的影响。方法将PLL3.7-HSPC238干扰载体稳定转染Hela细胞,然后将细胞接种到BALB/c裸鼠前肢腋部皮下,观察肿瘤出现时间及体积变化。结果转染了PLL3.7-HSPC238干扰载体组的裸鼠肿瘤较对照组生长快,肿瘤的体积明显大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论干扰HSPC238对宫颈癌Hela细胞裸鼠成瘤具有促进作用。

HSPC238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨高表达和干扰HSPC238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响。方法将pc DNA3.1-HSPC238高表达和p LL3.7-HSPC238干扰载体分别瞬时转染Hela细胞,然后采用Ed U增殖和Transwell侵袭实验,检测HSPC238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响。结果与对照组相比,转染了pc DNA3.1-HSPC238质粒的Hela细胞增殖和侵袭能力下降,转染了p LL3.7-HSPC238质粒的Hela细胞增殖和侵袭能力增强,以上结果均有统计学差异(P<0.05)。结论HSPC238高表达时能抑制Hela细胞的增殖和侵袭,干扰HSPC238时促进Hela细胞的增殖和侵袭。

PSMA7对A549细胞中RB途径的影响

目的:探究高表达和干扰PSMA7对A549细胞周期以及RB途径中Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影响。方法:将pcDNA3.1-PSMA7高表达和pGPU6/Hygro-PSMA7-265干扰载体分别瞬时转染A549细胞,然后用流式细胞仪检测PSMA7对细胞周期的影响,再通过Western blot实验检测Cyclin D1、CDK4、P16、Rb的蛋白水平。结果:和对照组相比,PSMA7高表达时周期时相分布无明显差异,但Cyclin D1、CDK4的蛋白表达水平明显降低,P16、Rb的表达明显增高;和对照组相比,干扰PSMA7后细胞的G0/G1、G2/M期比例均降低,而S期的值增高,均具有差异,而Cyclin D1、CDK4的蛋白表达水平明显增加,P16、Rb的表达明显降低,以上结果与对照组相比差异均有统计学意义。结论:PSMA7在A549肺腺癌细胞中能够影响RB途径中Cyclin D1、CDK4、P16、Rb的蛋白水平的表达,干扰PSMA7使A549细胞较早进入S期。