4-1BBL联合Hsp70-肿瘤抗原肽抑制小鼠黑色素瘤肺转移

背景与目的正调节性共刺激分子表达偏低是肿瘤逃避机体免疫系统攻击的重要原因之一,增加这些分子的表达是促进抗肿瘤免疫的研究热点。小鼠黑色素瘤B16-F1细胞株是弱免疫原性癌细胞株。本研究旨在观察4-1BBL联合Hsp70-抗原肽对小鼠黑色素瘤肺转移的抑制作用,并探讨其机制。方法建立小鼠黑色素瘤肺转移模型,Hsp70-B16抗原肽小鼠皮下免疫,同时从尾静脉注射4-1BBL表达质粒p4-1BBL。于接种后第17天,解剖小鼠取肺组织,解剖显微镜下计数黑色素瘤肺转移结节的数目,并检测小鼠部分免疫学指标及肝、肾功能。结果4-1BBL联合Hsp70-B16抗原肽治疗组小鼠黑色素瘤肺转移结节数降至50±8,明显少于二者单独治疗组的500±80和450±40;联合治疗组小鼠血清IL-2和IFN-γ的分泌水平分别增加了4倍和3倍,与对照组相比均存在显著性差异(P<0.01);单独应用4-1BBL基因或与Hsp70-B16抗原肽联合应用对小鼠肝、肾的功能均无明显影响。结论表达4-1BBL联合应用Hsp70-B16抗原肽主要通过增强外周T淋巴细胞功能活性而有效抑制小鼠黑色素瘤肺转移。

感染非典型新城疫蛋鸡组织中HSP70抗原肽复合物提取与纯化

为建立从患有非典型新城疫的蛋鸡组织细胞中提取、纯化热休克蛋白HSP70抗原肽复合物的方法,采取三步蛋白纯化法从非典型新城疫蛋鸡肝脏组织中提取、纯化HSP70抗原肽复合物。经分级硫酸铵盐析后,依次用ConA-Sepharose亲和层析和DEAE-Sephacel离子交换层析分离纯化。所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting进行蛋白分子量及性质鉴定,Bradford法测定蛋白浓度。分离、纯化得到的蛋白经SDS-PAGE、银染鉴定为单一带,分子量为70ku;Western blotting结果证实为HSP70。每克新鲜肝脏细胞最终获得90～110μgHSP70。使用本分离纯化方法可获得高纯度HSP70抗原肽复合物。

Hsp70-肿瘤抗原肽复合物修饰的DC疫苗体内外特异性抗瘤作用

目的 :探讨树突状细胞 (DC)及Hsp70 肿瘤抗原肽复合物修饰后的体内外特异性抗瘤作用。方法 :采用一定的生化技术 ,从H2 2肝癌细胞中提取肿瘤抗原肽 ,并在体外与Hsp70进行结合 ;采用细胞培养技术 ,培养rmGM CSF、rmIL 4诱导的小鼠骨髓细胞 ,体外获取大量的DC ,后者经Hsp70 肿瘤抗原肽复合物修饰后刺激小鼠脾淋巴细胞 ,通过MTT法进行检测淋巴细胞的激活 ;收集上述刺激传代培养的淋巴细胞 ,检测其对H2 2瘤细胞和艾氏腹水癌细胞的杀伤功能 ;采用H2 2瘤细胞肌肉接种和H2 2瘤细胞、艾氏腹水癌细胞腹腔接种 ,对接种小鼠给予经体外修饰的DC回输 ,观察其抑制肿瘤的效果。结果 :Hsp70 肿瘤抗原肽复合物可使DC成熟 ,大量分泌IL 12、TNF α、IL 1β等细胞因子 ,并能够使DC激活小鼠脾淋巴细胞 ;激活后传代培养的淋巴细胞对H2 2瘤细胞能够特异性地杀伤 ,而对艾氏腹水癌细胞无效 ;经Hsp 70 肿瘤抗原肽复合物修饰后的DC可作为一种有效的瘤苗 ,体内能特异性地抑制小鼠H2 2肿瘤生长。结论 :Hsp70 肿瘤抗原肽复合物能够很好地修饰体外诱导获取的DC ,使后者成为一种有效的瘤苗 ,体外能够特异性地激活淋巴细胞 。

细粒棘球蚴Eg HSP20蛋白基因的分子特征、表达及其反应原性研究

【目的】本文构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)HSP20基因的重组表达载体并表达、纯化重组蛋白,研究其反应原性。【方法】根据Gen Bank中Eg HSP20蛋白基因c DNA序列设计特异性引物,以细粒棘球蚴Eg头节总RNA为模板,进行RTPCR扩增,将PCR产物克隆至p MD19-T载体,测序验证后,将Eg HSP20抗原基因亚克隆至表达载体p ET-32a中,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内,用IPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行纯化及反应原性分析。【结果】Eg HSP20 c DNA全长945个核苷酸,编码314个氨基酸。该多肽含有1个N端糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,5个PKC磷酸化位点,10个CKⅡ磷酸化位点;抗原表位区集中在39~53位和120~168位。SDS-PAGE检测显示,重组菌可表达分子量为51 k Da的重组蛋白;Western blot结果显示,表达的重组蛋白Eg HSP20抗原能与Eg阳性血清发生特异性反应。【结论】证实Eg HSP20蛋白具有较强的反应原性,为进一步利用Eg HSP20重组蛋白作为Eg感染诊断中候选标识分子奠定了前期基础。

其它（051124～051144）

多次小剂量pEgr-IFN-γ基因-放射治疗的抑瘤效应及其机制的研究；Hsp70-肿瘤抗原肽复合物防治小鼠黑色素瘤B16肺转移的作用；CA72-4在10种恶性肿瘤患者血清中的临床界值；肿瘤库(用于分子生物学研究)的建立及管理；围手术期营养支持对外科病人预后的影响；

人热休克蛋白对树突状细胞表面共刺激分子表达影响的研究

目的:研究人热休克肿瘤抗原复合物对树突状细胞(dendritic cells,DC)表面共刺激分子表达的影响。方法:分离培养人外周血来源的DC细胞,在培养过程中加入分离纯化的人热休克蛋白70(HSP70)抗原复合物及肿瘤细胞裂解物,流式细胞技术分析比较负载HSP70肿瘤抗原复合物、负载肿瘤细胞裂解物及负载前DC细胞表面分子CD80、CD83、CD86及HLA-DR表达水平的变化。结果:培养基中加入HSP70肿瘤抗原复合物后,其表面共刺激分子CD80、CD86和成熟标记分子CD83的表达水平分别为(98.9±1.5)%、(98.3±1.3)%和(53.1±0.8)%,与负载前CD80、CD86和CD83的(66.2±1.6)%、(94.2±2.0)%和(16.3±1.4)%相比显著提高,P=0.013;与肿瘤细胞裂解物负载的DC表面CD80、CD86和CD83的(86.2±1.9)%、(96.5±1.1)%和(55.1±1.0)%相比,共刺激分子CD80的表达显著提高,P=0.020。结论:人热休克肿瘤抗原复合物可提高DC表面共刺激分子的表达水平,促进DC功能活化,有可能在抗肿瘤免疫机制中起重要作用。