HSV_1-TK转染人肺腺癌细胞A549的实验研究

目的 体内外观察HSV1 TK/GCV对人肺腺癌细胞A5 49的杀伤效应。方法 构建含TK基因的逆转录病毒表达载体 ,电穿孔法转化肺癌细胞A5 49。MTT法检测转染细胞对GCV的药物敏感性 ,并观察旁观者效应 ;电镜、FCM、TUNEL法检测GCV诱导转染细胞凋亡变化 ;PCR和细胞原位杂交分别检测转染细胞TK基因整合和表达 ;活体内观察GCV对转染细胞、亲代细胞接种裸鼠皮下肿瘤治疗效果。结果 转基因细胞变得较不规则 ,多角型 ,易形成空泡。A5 49、A5 49 PLXSN、A5 49 TK三种细胞体外倍增时间分别为 ( 3 6.15± 3 .2 7)、( 4 0 .82± 3 .75 )和 ( 4 2 .0 6± 4.12 )小时 (P >0 .0 5 )。转染细胞对GCV的敏感性比亲代细胞提高 46倍 (P<0 .0 0 1)。旁观者效应在高细胞密度接种 ( 1× 10 4细胞 /孔 )较低细胞密度接种 ( 1× 10 3细胞 /孔 )明显。电镜发现转染细胞有凋亡小体、核呈半月征。FCM、TUNEL均能检测到转染细胞凋亡发生率明显高于对照细胞 (P<0 .0 0 1)。PCR及原位杂交表明转染细胞有TK基因整合和表达。体内实验表明GCV能明显抑制转染细胞接种的肿瘤 ,而亲代细胞接种的肿瘤未受抑制。结论 转TK基因细胞在体内外都获得了对GCV的敏感性。TK/GCV系统杀灭肿瘤可能与诱导细胞凋亡有关。GCV能在活体内抑制转TK基因细胞裸鼠移?

多西环素对小细胞肺癌H446细胞增殖及HIF表达的影响

目的探讨多西环素对小细胞肺癌H446细胞增殖及HIF-1α和HIF-2α表达的影响。方法采用MTT法检测多西环素对H446细胞增殖抑制作用。采用倒置相差光学显微镜观察多西环素对细胞凋亡形态的影响。通过流式细胞仪合并Cell Fit软件对细胞周期分布进行分析,采用Annexin V-FITC荧光染色检测细胞凋亡率。采用细胞健康分析软件检测细胞内线粒体膜电位。实时荧光定量PCR检测HIF-1α和HIF-2α表达。Western blot法检测凋亡相关蛋白表达。结果多西环素(2.5、5、10、20、40、80 mg/L作用24或48小时)呈剂量-时间依赖性抑制H446细胞增殖。经光学显微镜可明显观察到多西环素能导致H446细胞凋亡,呈时间-剂量依赖性。流式细胞仪结果显示,10、20、40 mg/L多西环素作用48小时能阻滞H446细胞周期S期,并且随着细胞凋亡率增加,呈剂量依赖性。浓度为10、20、40 mg/L多西环素作用48小时的细胞线粒体膜电位低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);经10、20、40 mg/L多西环素作用48小时的细胞HIF-1α、HIF-2αmRNA表达均低于对照组(均P<0.05),HIF-1α、HIF-2α蛋白表达量低于对照组,且HIF-1α和HIF-2α变化趋势均相同,随着多西环素浓度增加、表达量降低(P<0.05)。结论多西环素对小细胞肺癌H446细胞具有增殖抑制作用,且呈剂量-时间依赖性,可阻滞细胞于S期,降低线粒体膜电位,下调HIF-1α、和HIF-2α蛋白表达,且伴随有H446细胞凋亡的现象。

转化生长因子β_1正反义基因对人肺巨细胞癌细胞体内外增殖的影响

探讨人转化生长因子β１（ＴＧＦβ１）正反义基因对人肺巨细胞癌细胞（ＰＬＡ－８０１Ｄ）增殖的影响及调控。方法通过基因转染方法，将ＴＧＦβ１正、反义基因分别导入ＰＬＡ－８０１Ｄ细胞，观察转染和未转染细胞体内外增殖变化、ｎｍ２３基因和ｃ－ｍｙｃ基因表达以及细胞凋亡特征。结果与未转染细胞比较，正义ＴＧＦβ１基因转染细胞培养上清中ＴＧＦβ１活性增加，体外生长速度减慢，软琼脂细胞培养集落形成能力降低，裸鼠体内成瘤率下降约４７％，肿瘤的转移受到抑制。其机制可能与正义ＴＧＦβ１基因转染细胞ｎｍ２３基因表达增加，ｃ－ｍｙｃ基因表达减少以及诱发细胞凋亡有关。而反义ＴＧＦβ１基因转染细胞则出现相反结果。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在肺癌基因治疗实验中的初步探讨

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶＴＫ）基因在肺腺癌基因治疗中的应用。方法对转导了ＨＳＶＴＫ基因的感染人肺腺癌细胞Ａ５４９（Ａ５４９／ＴＫ）和野生型Ａ５４９，采用噻唑蓝（ＭＴＴ）法测定不同浓度丙氧鸟苷（ＧＣＶ）作用７２小时后的细胞存活率，求得半抑制浓度（ＩＣ５０）。动物实验将９×１０６的Ａ５４９／ＴＫ或野生型Ａ５４９细胞接种于Ｂａｌｂ／ｃｎｕ／ｎｕ裸鼠的皮下，当肿瘤长至２００～３００ｍｇ时，随机分组。Ａ５４９／ＴＫ组（１组）荷瘤小鼠给予每天１００ｍｇ／ｋｇＧＣＶ腹腔注射，连续给药２周，对照组（２组）Ａ５４９／ＴＫ给予生理盐水，野生型Ａ５４９组（３组）给予等量ＧＣＶ，从给药开始之日起，每周二次测量肿瘤大小，按经验公式计算肿瘤相对重量。结果体外细胞毒实验：在２０μｍｏｌ／ＬＧＣＶ存在时，野生型Ａ５４９形态无明显改变，而实验组细胞明显死亡。ＧＣＶ对野生型Ａ５４９的ＩＣ５０为５００μｍｏｌ／Ｌ，对Ａ５４９／ＴＫ的ＩＣ５０为０５μｍｏｌ／Ｌ，二者相差１０００倍（Ｐ＜０．０１）。动物实验：腹腔注射ＧＣＶ可使Ａ５４９／ＴＫ皮下肿瘤显著缩小。从注射之日起到１７天时，肿瘤体积下降了９２％，而ＧＣＶ对野生型Ａ５４９肿瘤?