四环素调控复制缺陷性疱疹病毒载体介导LacZ基因在原代培养神经元中的表达

目的利用四环素调控复制缺陷性单纯疱疹病毒I型重组载体(QR9TO-LacZ)感染体外原代培养的大鼠皮层神经元,探讨其介导半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达情况及基因调控效能;并检测该载体对神经元活力的影响。方法用RUL9-8细胞系扩增QR9TO-LacZ病毒株,收集后采用噬斑法测定病毒滴度;体外原代培养大鼠皮层神经元。将培养的原代神经元分为强力霉素(DOX)组和对照组。两组细胞均用QR9TO-LacZ转染,强力霉素组加入四环素衍生物强力霉素(0.5μg/ml),对照组加入等剂量空白对照液。同时根据感染复数(MOI),即MOI=3、5、10、30 PFU/cell,将两组培养细胞进一步分为亚组。病毒转染48h后行X-gal染色;光镜下观察神经元形态,随机选取10个高倍镜视野(×400),计算每高倍镜视野中平均蓝染细胞率,比较不同MOI病毒感染神经元的效率。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测感染病毒48 h(MOI同上)后神经元的活性。结果在含有DOX的培养环境中,不同MOI亚组(3、5、10、30 PFU/cell)QR9TO-LacZ感染神经元出现蓝染细胞百分比分别为5.35%±0.84%、10.64%±1.92%、19.73%±2.87%、34.41%±2.58%;在无DOX的培养环境中,各亚组均未观察到蓝染细胞。上述MOI感染的神经元细胞存活率分别为:90.24%±8.16%、88.00%±5.69%、83.95%±3.82%、78.90%±5.49%。结论 QR9TO-LacZ载体能有效地将目的基因导入原代培养神经元中并表达;目的基因表达的开启受强力霉素调控;QR9TO-LacZ对体外原代培养神经元毒性较低。

肝癌选择性溶瘤腺病毒的构建及其体外抑瘤作用

目的:构建由AFP基因增强子-启动子调控,并携带自杀基因TK的新型条件复制型腺病毒载体,观察该载体的选择复制能力、溶瘤作用及其与前药GCV联合处理对肝癌细胞的杀伤作用。方法:以HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增AFP基因启动子(AFPp)和增强子(AFPe),构建表达质粒pAFPp-EGFPluc和pAFPep-EGFPluc,再构建由AFPep调控E1A表达、并携带TK基因的穿梭质粒pDC311-AFPep-E1A/CMV-TK,利用AdMax系统包装腺病毒Ad.AFPep-E1A/CMV-TK;利用Western blotting、病毒增殖测试、细胞病变效应实验、病毒联合前药GCV对肝癌细胞的杀伤实验等鉴定病毒的复制能力、溶瘤作用和对肝癌细胞的杀伤作用。结果:成功构建的腺病毒载体Ad.AFPep-E1A/CMV-TK在AFP阳性细胞中选择性复制,病毒自身具有一定的溶瘤作用;该病毒载体联合GCV前药系统处理肝癌细胞后,AFP阳性肝癌HepG2细胞和Hep3B细胞的存活率分别为(10.35±1.07)%、(15.49±5.80)%,AFP阴性的张氏肝细胞和人肺癌NCIH460细胞的存活率分别为(73.55±4.36)%、(74.54±9.89)%(P<0.01)。结论:构建的新型溶瘤腺病毒载体具有选择性杀伤肝癌细胞的能力,在肝癌治疗方面有良好的应用前景。