HSV-tk基因表达载体构建与检测

目的构建含有HSV-tk基因的逆转录病毒载体。方法将HSV-tk基因导入质粒,用电转法或CaCl2法转化感受态大肠杆菌进行扩增。结果经限制性酶切分析及PCR方法鉴定,目的基因大小、位置、方向均正确无误。结论HSV-tk载体的成功构建为肿瘤基因治疗提供部分实验基础。

腺病毒介导的HSV-tk基因治疗人膀胱癌的动物实验研究

目的 探讨带有HSV -tk基因的重组腺病毒 (Ad -tk)结合GCV对人膀胱癌的治疗作用。方法 建立人膀胱癌裸鼠移植瘤模型 2 1只 ,采用肿瘤原位注射Ad -tk结合GCV治疗。结果 5× 10 8PFU的Ad -tk肿瘤原位注射结合GCV治疗 ,能明显抑制肿瘤生长 ,肿瘤平均重量为 0 .2 1g ,病理检查表明肿瘤组织坏死、出血伴纤维组织增生 ;而 3个对照组Ad -tk/PBS组、PBS/GCV组、PBS组肿瘤平均重量分别为 1.6 0、1.5 2、1.71g。与对照组比较 ,肿瘤生长抑制率分别为 86 .9%、86 .2 %、87.7% ,有显著性差异 (均P <0 .0 1)。结论 Ad -tk/GCV系统对人膀胱癌的敏感性较高 ,疗效显著。

HSV-tk/GCV自杀基因系统对骨肉瘤细胞体外杀伤效应

目的 :观察HSV tk/GCV系统对骨肉瘤细胞SAOS 2的体外杀伤作用 .方法 :构建tk基因逆转录表达载体pL(tk)SN ,在lipofectamine2 0 0 0介导下转染PA31 7包装细胞 ,G4 1 8筛选 ,直至出现抗性克隆 ,扩大培养 ,用NIH3T3测定病毒滴度 ,将重组病毒感染人骨肉瘤细胞SAOS 2 ,G4 1 8筛选出抗性克隆命名为SAOS/tk ,以RT PCR及Southernblot检测tk基因的整合及表达 .观察tk基因修饰细胞生长状况及MTT法观察前药对tk基因修饰骨肉瘤细胞的杀伤效应 .结果 :RT PCR及South ernblot分析证明tk基因在人骨肉瘤细胞系SAOS 2中有整合及表达 ;SAOS/tk与未转基因的原肿瘤细胞相比 ,两者生长速度及形态结构无明显差别 ;在前药敏感性试验中 ,GCV对SAOS/tk细胞的杀伤作用十分明显 ,半数致死量约为 1mg/L ,而亲本细胞SAOS 2和空白质粒转染SAOS/0细胞 ,半数致死量大于 1 0 0mg/L .tk基因修饰细胞与不同比例亲本细胞混合后经GCV治疗 ,SAOS/tk占混合细胞总数的 2 0 %时即可杀伤约 5 0 %的混合培养细胞 .结论 :人骨肉瘤细胞系SAOS 2对HSV tk/GCV系统高度敏感 ,并且有明显的旁观者效应 。

HSV-tk/GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞的旁观者效应及其机制研究

目的观察HSV-tk/GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的旁观者效应并研究其作用机制。方法将转HSV-tk基因HTFs(HTFs-tk)与正常HTFs于两种接种密度下以不同比例混合,加入5μg/m l更昔洛韦作用5 d,MTT法检测对HTFs的杀伤作用;染料传输法观察HTFs细胞间隙连接细胞间通讯(G JIC)的能力;免疫细胞化学检测Cx43分布;RT-PCR及W estern b lot检测Cx43表达。结果旁观者效应随HTFs-tk/HTFs比例增加而增强,高细胞接种密度组明显强于低密度组;染料通过G JIC传输6级以上;Cx43主要分布于HTFs细胞膜并检测到其mRNA与蛋白表达。结论旁观者效应需要细胞间密切接触,Cx43介导G JIC可能是HSV-TK/GCV系统对HTFs产生旁观者效应的主要机制,HTFs表达Cx43可能在结膜伤口愈合反应中发挥重要作用。

HRE增强hTERT启动子-tk/GCV基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的杀伤作用

目的:探讨缺氧反应元件(HRE)增强hTERT启动子-tk/GCV逆转录病毒基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的体外杀伤作用。方法:构建由HRE缺氧反应元件修饰的hTERT杂合启动子和hTERT单一启动子引导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因表达的重组逆转录病毒载体,在脂质体介导下分别转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。将重组病毒感染人肺癌细胞SPC-A1和人肝癌细胞Bel-7402,G418筛选出抗性克隆肿瘤细胞。实验分为对照组、SPC-A1/tk组和Bel-7402/tk组。在缺氧处理条件下,MTT法检测前体药物丙氧鸟苷(GCV)对SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞的杀伤效应,流式细胞仪检测其细胞凋亡率和细胞周期的变化。结果:与对照组比较,缺氧环境培养的SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞对GCV的敏感性明显增强,其中细胞凋亡率明显升高(P<0.001),细胞周期各期细胞数有所减少(P<0.05)。与hTERT启动子引导的tk基因系统组细胞比较,[HRE]hTERT杂合启动子引导的tk基因系统组肿瘤细胞存活率更低(P<0.01),诱导肿瘤细胞凋亡率明显升高(P<0.01),G1期和G0期细胞数有所增高(P<0.05),S期细胞数减少(P<0.05)。结论:HRE能增强hTERT启动子-tk/GCV自杀基因系统对缺氧环境中肿瘤细胞的体外杀伤作用。