靶向抗HSV-1的siRNA研究进展

单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)是一种能够在各类人群中携带和传播并能引起包括口唇疱疹、荚膜炎、角膜炎和病毒性脑炎等疾病的重要病原体。虽然已有多种类型的HSV-1疫苗处于研发的不同阶段,但仍没有商业化的疫苗上市销售。临床上使用的特异性抗HSV-1药物如阿昔洛韦、伐昔洛韦和喷昔洛韦等也面临严重的抗药性威胁,开发新的特异性抗HSV-1药物是当前所面临的主要任务之一。siRNA是一种长度为20~25核苷酸的双链RNA,通过在转录后水平上沉默基因表达发挥干扰作用。siRNA作为一种新的、有潜力的抗病毒药物备受关注,发展也较为迅速。综述近年来siRNA在抗HSV-1方面的研究进展,包括靶向HSV-1关键基因和HSV-1互作的宿主细胞基因的siRNA设计、递送和靶向策略。

复方毛冬青治疗HSV-1感染的临床效果分析及作用机制探讨

目的对复方毛冬青颗粒治疗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)感染的临床疗效进行分析,并通过网络药理学与分子对接探讨其作用机制。方法临床研究选取广州医科大学附属妇女儿童医疗中心2020年1月至2023年2月疱疹病毒性龈口炎患儿380例。观察组口服复方毛冬青治疗,对照组口服阿昔洛韦治疗。收集患者的一般资料,观察药物治疗效果、治疗时间等指标并进行统计。机制研究通过BATMAN-TCM数据库筛选有效活性成分及对应靶点,GeneCards数据库获得疾病靶点。运用STRING数据库和Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。DAVID数据库进行基因本体(GO)与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。通过Auto Dock与Pymol将关键活性成分和核心靶点进行分子对接验证。结果复方毛冬青治疗疱疹病毒性龈口炎痊愈率高于阿昔洛韦(P<0.05)。本研究共获得复方毛冬青活性成分40种,靶点1399个,与HSV-1感染的交集靶点213个。GO功能富集得到1016个条目,KEGG通路富集分析得到174条信号通路。分子对接显示关键成分与核心靶点有较强亲和能力。复方毛冬青中的白桦脂醇、喹唑啉酮、腺苷等关键成分可能通过作用于TP53、RELA、M-APK3等核心靶点干预癌症通路、脂质与动脉粥样硬化和人T细胞白血病病毒1感染等信号通路发挥其抗HSV-1病毒感染的作用。核心成分和靶点之间的结合能力较好。结论复方毛冬青通过多种有效成分,不同的通路发挥其治疗HSV-1感染的作用,具有良好的临床运用前景和研究价值。

新型溶瘤病毒HSV-1-ab-VISTA的构建及其抗肿瘤作用

目的探讨携带免疫检查点VISTA抗体的溶瘤病毒HSV-1-ab-VISTA在小鼠(C57BL/6J)移植瘤模型中的抗肿瘤效果.方法利用CRIPSR-Cas9基因编辑技术制备携带VISTA分子抗体的HSV-1-ab-VISTA溶瘤病毒;琼脂糖凝胶电泳检测VISTA抗体的基因组片段大小;蛋白免疫印迹法检测VISTA抗体表达情况;构建小鼠移植瘤模型,游标卡尺测量溶瘤病毒治疗后瘤体大小的变化,且进行分析.结果成功构建了携带免疫检查点VISTA抗体的溶瘤病毒HSV-1-ab-VISTA,和野生病毒相比,病毒增殖和裂解癌细胞的能力没有差别,HSV-1-ab-VISTA溶瘤病毒治疗显著缩小了小鼠的肿瘤大小.结论HSV-1-ab-VISTA溶瘤病毒可抑制小鼠结直肠移植瘤的生长.

一种新型1型单纯疱疹病毒mRNA疫苗的制备

制备用于防治1型单纯疱疹病毒感染的新型mRNA疫苗,并检测其免疫效果。利用同源重组技术构建HSV1糖蛋白gD胞外域(HSV1-gD^(Ectodomain))重组质粒,经PCR反应扩增HSV1-gD^(Ectodomain)基因模板,体外转录反应得到HSV1-gD^(Ectodomain)mRNA,利用LNP包封HSV1-gD^(Ectodomain)mRNA得到mRNA-LNP疫苗复合物,小鼠大腿肌肉接种mRNA-LNP疫苗复合物。ELISA法检测小鼠血清HSV1-gD抗体效价;TCID50法检测HSV1-gD血清中和效价。结果显示:经HSV1-gD^(Ectodomain)mRNA疫苗接种后,小鼠血清抗体滴度达到1∶12800,中和实验表明抗体可保护Vero细胞不受HSV1病毒感染。成功制备一种新型HSV1 mRNA疫苗,用其接种小鼠可诱导产生特异性免疫应答,并具有良好的保护作用。

千金藤素抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)初探

目的 :体外测定千金藤素抗单纯疱疹病毒Ⅰ型的作用 ,为筛选新型抗病毒药物提供参考依据。方法 :用不同稀释度的千金藤素抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型对Vero细胞的感染作用 ,4 8h后观察细胞病变 (CPE)效应。结果 :千金藤素能明显抑制HSV 1对Vero细胞的致病变作用 ,使细胞存活率升高。结论 :千金藤素有较显著的抗HSV 1的作用 ,且抗病毒作用是多方面的 ,是一种具有潜在开发前景的药物。

藏药紫金标抗HSV-1的作用机理研究

目的 :探讨紫金标抗单纯疱疹Ⅰ型病毒 (HSV 1)的作用及机理 ,为进一步开发该药提供理论依据。方法 :采用不同剂量的紫金标作用于适量HSV 1感染的Vero细胞 ,以 5 0 %组织细胞感染量 (TCID50 ) ,细胞病变效应(CPE) ,MTT法和核酸分子杂交作为评价指标。结果 :MTT法测得紫金标的 5 0 %抑制浓度 (IC50 )为 2 9.4 6mg·L-1,5 0 %中毒浓度 (TC50 )为 10 77mg·L-1,治疗指数 (TI)为 36 .5 6 ,结果表明紫金标有明显抑制HSV 1的作用 ,其作用强度和有效时间与药物浓度成正比。紫金标无直接灭活HSV 1的作用 ,也不能影响病毒的释放 ;但可干扰HSV 1对宿主细胞的吸附。不同浓度的紫金标能明显抑制HSV 1gD基因复制和mRNA表达。结论 :紫金标具有显著的抗HSV 1的作用 ,能抑制HSV 1对宿主细胞的吸附以及抑制HSV

螺旋藻多糖抗HSV-1作用的体外实验研究

报道从钝顶螺旋藻中提取的一种水溶性多糖类化合物 ,即钝顶螺旋藻多糖(PSP) ,在培养细胞内抗单纯疱疹病毒 1型 (HSV 1)作用的研究。以不同剂量的PSP作用于病毒复制周期的各个阶段 ,以病毒半数感染量 (TCID50 ) ,细胞病变 (CPE) ,蚀斑形成(PFU) ,MTT染色细胞保护率 (MTT法 )及核酸分子杂交作为评价指标 ,判断药效。结果表明 :PSP对Vero细胞毒性极低 ;对HSV 1无直接灭活作用 ,可干扰病毒向宿主细胞吸附 ,且经PSP预处理的细胞 ,能明显阻滞病毒产生细胞病变 ;PSP可有效地抑制病毒复制 ,但不影响病毒的释放 ;PSP可明显抑制HSV 1糖蛋白 gGmRNA的表达。提示PSP抗病毒靶位在于阻断病毒吸附和抑制感染细胞内病毒的复制及抑制HSV 1糖蛋白 gG基因的转录。

HSV-1致Hela细胞凋亡的扫描电镜及透射电镜观察

目的 探讨HSV 1感染Hela细胞时 ,是否发生凋亡。方法 用扫描电镜及透射电镜观察感染 72h的Hela细胞的形态变化。结果 正常的Hela细胞表面有丰富的微绒毛。细胞间隔清晰 ,可见幼稚连接 ,连接不紧密。胞浆内线粒体嵴结构完整 ,并可见大量的粗面内质网及游离核糖体 ,极少的脂滴。细胞核内多为常染色体 ,核仁清晰 ,核浆比约 1∶1。凋亡细胞中核内异染色质增多 ,染色质浓缩成块状 ,边集于核膜。线粒体轻度肿胀 ,溶酶体代偿性增多。核膜、胞膜、各细胞器膜均完整。坏死细胞的染色质呈不规则的团块状 ,但不象凋亡细胞那样集中于核周边。细胞膜、核膜和细胞器的结构破坏 ,线粒体空泡变 ,细胞崩解 ,胞浆及其内容物外泄。HSV 1感染的Hela细胞体积明显缩小 ,核浆比例明显增加。细胞表面的微绒毛断裂、减少 ,细胞膜球状突起。核膜完整 ,核致密 ,呈块状分布 ,边集于核膜。细胞膜、细胞器结构完整。可见出泡现象和凋亡小体形成现象。在胞核内可见病毒体。结论 ①HSV 1感染Hela细胞时 ,造成细胞死亡形式是核死亡形式即凋亡 ;②HSV 1感染Hela细胞时 ,细胞凋亡占绝对优势 。

海南红树林淡紫拟青霉EPS纯化物体外抗HSV-1实验研究

目的:探讨海南红树林淡紫拟青霉胞外多糖(EPS)纯化物体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)活性,为开发新型抗病毒药物提供基础研究。方法:以Vero细胞为病毒感染靶细胞,以不同浓度EPS纯化物作用于HSV-1感染过程的各个阶段,以细胞病变程度(CPE)测定病毒半数感染量(TCID5 0),MTT法检测该纯化物对Vero细胞的毒性作用及对HSV-1的直接灭活作用、对病毒吸附和生物合成的影响。结果:EPS纯化物对Vero细胞无增殖作用,其半数有毒浓度(CC5 0)为735.49μg/mL,纯化物在400μg/mL以下时,细胞存活率达90%以上;在所用浓度范围内该纯化物可不同程度抑制病毒吸附,抑制率最高达35.0%,与病毒对照组相比差异具有显著性(P<0.01);该纯化物还具有抑制HSV-1生物合成作用,抑制率与药物浓度呈现出量效关系,其半数抑制浓度(IC5 0)为387.26μg/mL,最高抑制率达61.3%;在所用浓度范围内未发现该纯化物对HSV-1有直接灭活作用。结论:红树林来源的淡紫拟青霉EPS纯化物对Vero细胞毒性较小;该纯化物在一定浓度范围内可抑制HSV-1吸附和生物合成,且抑制生物合成作用较强,并表现出一定量效关系。

藏药紫金标抗HSV-1作用的体内实验研究

目的探讨藏药紫金标抗单纯疱疹病毒I型(HSV-1)的体内作用。方法对小鼠进行HSV-1的角膜局部接种、尾静脉全身接种两种HSV-1感染的动物模型,观察紫金标对疱疹性角膜炎和HSV-1全身感染的治疗作用。结果紫金标可减轻组织的病理损害,明显减少或消除脏器内的病毒抗原,最大无毒剂量(0.3g/kg/d)的紫金标对HSV-1有明显的对抗作用,其效果与临床用的抗病毒药物ACV近似;紫金标对疱疹性角膜炎有治疗作用。结论紫金标有抗HSV-1的药效学作用,对疱疹性角膜炎和HSV-1全身感染有较明显的治疗作用。

甘草甜素对HSV-1抑制作用的实验研究

目的:观察甘草甜素对单纯疱疹病毒Ⅰ型的抑制作用,为临床更为有效的治疗单纯疱疹病毒性脑炎探索新的药物。方法:体外培养Vero细胞,分成甘草甜素在病毒吸附vero细胞后加入病毒、吸附前甘草甜素预处理细胞以及吸附前甘草甜素预处理病毒,通过观察空斑形成单位来评价甘草甜素对单纯疱疹病毒Ⅰ型的抑制作用,以及作用发生于病毒感染的哪个阶段。结果:病毒吸附vero细胞后加入甘草甜素能明显抑制病毒所致的空斑形成,IC50 为0 .5 6mmol/L。吸附前甘草甜素预处理细胞以及吸附前甘草甜素预处理病毒,对病毒所致的空斑形成无明显影响。结论:甘草甜素能明显地抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型的复制,它的作用是发生在病毒穿入细胞后的阶段,不能阻止病毒对细胞的吸附。

HSV-1感染对神经胶质瘤细胞NGF和BDNF表达变化的研究

目的:探讨单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染时神经胶质细胞内源性神经生长因子(NGF)和脑源性神经生长因子(BDNF)的表达变化。方法:采用RT-PCR法检测HSV-1糖蛋白D(gD)基因扩增,RT-PCR法和Westernblotting法检测正常培养和感染HSV-1的神经胶质瘤(U251)细胞的NGF和BDNF。结果:HSV-1可感染U251细胞;正常U251细胞可表达NGF和BDNF;HSV-1感染U251细胞后,NGF和BDNF在感染后第6小时达高峰,之后随感染时间延长逐渐降低。结论:HSV-1可诱导U251细胞中的NGF和BDNF表达异常。

HSV-1感染细胞中HTRP基因的克隆及表达纯化

在对单纯疱疹病毒 1型 (HSV - 1)感染KMB - 17细胞后的早期基因反应的研究中 ,从HSV - 1感染后细胞特异性cDNA文库中筛选出一个 1381bp基因—HTRP ,基因测序分析表明为与HSV - 1感染相关基因 (GenBank登录号 :AF45 0 482 ) ,含有完整的ORF框架 ,cds全长 92 4bp ,编码 30 8个氨基酸。构建了 pGEX -HTRP表达质粒 ,在大肠杆菌BL2 1中获得了较高的表达 ,采用GlutathioneSepharose4B进行亲和纯化后获得较高纯度的HTRP蛋白。用该蛋白免疫小鼠后制备的特异抗血清 ,在蛋白印迹实验中表现出抗体的特异性。

HSV-1感染大鼠骨髓间充质干细胞及形成潜伏感染的初步研究

在体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察单纯疱疹病毒1型感染骨髓间充质干细胞情况。分离并鉴定BMSCs;HSV-1感染BMSCs,观察细胞病变(CPE);建立BMSCs的HSV-1潜伏感染模型。提取总DNA,PCR法扩增BMSCs内的HSV-1特异性片段,检测HSV-1感染BMSCs及潜伏感染。结果显示骨髓间充质干细胞经14d诱导后,碱性磷酸酶含量增高、形成钙结节,表现出成骨细胞特性。HSV-1感染BMSCs,出现典型的CPE,PCR法证实BMSCs内存在HSV-1的特异性片段。HSV-1潜伏感染的BMSCs,未出现明显的CPE,细胞传至7代,仍可测到HSV-1的基因片段,表明BMSCs有可能形成HSV-1的潜伏感染。大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞。HSV-1可以在体外感染骨髓间充质干细胞并有形成潜伏感染的趋势。

抗生素S_(632)A_3在体外抗肠道病毒及单纯疱疹病毒I型(HSV-1)作用的初步研究

目的 :体外测定抗生素S632A3 抗肠道病毒及单纯疱疹病毒I型的作用 ,为筛选新型抗病毒药物提供参考依据。方法 :用不同稀释度的抗生素S632A3 抑制3种肠道病毒及单纯疱疹病毒I型对Vero细胞的感染作用 ,48h后观察细胞病变效应 ,并用MTT法测定细胞活性。结果 :抗生素S632A3 能明显抑制肠道病毒及疱疹病毒对Vero细胞的致病变作用 ,使细胞存活率升高。结论 :该药物有较显著的抗肠道病毒及单纯疱疹病毒I型的作用 ,且对细胞的毒性很低 ,是一种具有潜在开发前景的药物。

HSV-1 UL-12基因的克隆、表达及产物复性

目的:克隆及表达单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)UL12基因,对其表达产物HSV-1碱性核酸酶(AN)进行复性,为建立抗HSV-1药物的分子筛选模型奠定了基础,对于寻找抗病毒药物具有重要意义。方法:从HSV-1感染的Vero细胞中提取HSV-1基因组DNA,通过PCR克隆出UL12基因并对其测序;然后将HSV-1 UL12基因先克隆至pMD19-T载体,再亚克隆到pET32a表达载体上,并将重组载体转化到E.coli Rosetta菌中进行表达;最后用梯度盐酸胍对表达出的包涵体进行复性。结果:成功构建了pET32a-UL12重组载体,经序列比对,与GenBank上公布的HSV-1国际标准毒株17株的UL12基因序列的同源性达到了99.2%。在E.coli Rosetta菌中以包涵体的形式表达,经复性得到有活性的HSV-1碱性核酸酶(AN)。AN同时具有核酸外切酶和核酸内切酶的活性,与核酸作用60min时酶活性最高。结论:重组载体pET32a-UL12经表达、复性可获得有活性的HSV-1 AN。

复发性口疮患者HSV-1的检测及其抗病毒治疗观察

目的：为了研究单纯疱疹病毒Ⅰ型与复发性口疮的关系。方法：采用PCR技术检测复发性口疮患者（ROU）损害区和健康对照者口腔粘膜脱落细胞的HSV－1DNA，然后对HSV－1DNA阳性和阴性患者用无环鸟苷作抗病毒治疗，并观察半年。结果：ROU患者HSV－1DNA的检出率为26.7%（16/60），对照组为6．7%（2／30），两者之间有高度显著性差异（P＜0．005）。HSV-1DNA阳性者与阴性者抗病毒治疗有效率分别是93．75％和13．6%（P＜0．005）。结论：HSV-1与部分ROU有关，对HSV－1阳性患者宜作抗病毒治疗。

pLTRNL介导HSV-1 TK基因长期稳定转染人肝癌细胞系的建立

以脂质体基因转移技术，将含ＨＳＶ１ＴＫ基因的重组逆转录病毒载体ｐＬＴＲＮＬ转染人肝癌细胞系ｈＨＣＣ。经抗生素Ｇ４１８选择，筛选出ＨＳＶ１ＴＫ基因转染的ｈＨＣＣ，再进行克隆化和亚克隆化后扩大培养。应用ＰＣＲ，ＲＴＰＣＲ及ｓｌｏｔｂｌｏｔ狭槽印迹等方法，对转染细胞基因组ＤＮＡ和总ＲＮＡ进行了鉴定。结果表明，ＨＳＶ１ＴＫ基因已整合入ｈＨＣＣ细胞基因组中，且有ＴＫ基因的ｍＲＮＡ转录。ＨＳＶ１ＴＫ基因稳定转染的ｈＨＣＣ的建立，为在体外和动物模型上对肝癌进行基因治疗奠定了实验基础。

特异性干扰ICP27基因的siRNA对HSV-1病毒复制的影响

针对单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus 1,HSV-1)的ICP27基因和其他疱疹病毒相关基因的高度保守区设计小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),研究其抑制病毒复制的效果。首先构建相应的小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA),然后通过病毒滴度测定、real-time PCR和细胞致病变效应(cytopathic effect,CPE)检测所设计的siRNA抑制病毒复制的能力。结果显示,所设计的shRNA-2(靶序列起始位置815)和shRNA-3(靶序列起始位置1 367)具有明显地抑制病毒复制的效果。尤其是shRNA-3,抑制病毒复制的效果更明显,在病毒滴度实验中,与阴性对照相比,其抑制倍数为81,同时可以下调ICP27基因的mR NA表达水平。实验结果表明shRNA-3能够显著抑制HSV-1病毒复制的能力,可以作为HSV-1感染性疾病的补充治疗手段,其对应的靶序列可以作为抗HSV-1新的靶标。

HSV-1 SM44株糖蛋白D基因真核表达载体的构建及其免疫效果观察

目的构建HSV 1型SM44株糖蛋白D(gD)基因的真核表达载体 ,并用此重组质粒直接免疫小鼠 ,探讨HSV 1gD基因作为基因疫苗的可能性。方法从HSV 1基因组中扩增 gD的全编码基因 ,克隆入载体 pUC19中 ,测序鉴定后转入真核表达载体 pcDNA3.1( +)。所得重组质粒pcDNA gD以电穿孔法转染CHO细胞 ,并以荧光染色法鉴定表达效果。用 pcDNA gD免疫小鼠 ,ELISA法检测基因免疫的应答效果。结果成功地构建了可在真核细胞中有效表达的HSV 1gD真核表达载体 ,用其直接免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答。结论 gD的真核表达载体有可能作为HSV 1的基因疫苗 ,为进一步研究基于 gD的表位生物学和表位疫苗奠定了基础。