HSV-1扩增子载体对神经系统疾病治疗作用的研究进展

单纯疱疹病毒1型（herpessimplexvirustype-1，HSV-1）具有强神经亲嗜性，已经被广泛的用来构建各种基因转移载体。常见的HSV—1源性基因载体包括条件复制性载体，复制缺陷型载体和HSV-1扩增子载体。

以HSV-1扩增子载体构建的新型重组AAV载体包装系统

将缺失两端ITR的AAV 2基因组克隆于HSV 1扩增子载体获得了质粒pHSV AAV .以HSV 1tsK株为辅助病毒感染转染了该质粒的Vero细胞 ,可获得一种具有包装重组AAV质粒能力的混合毒种 .连续传代可使其包装能力迅速升高 ,至 5～ 6代达到最高并趋于平稳 .此混合毒种中 ,含有包装了多拷贝AAV 2基因组的复制缺陷性假型HSV 1病毒 ,它可表达AAV 2编码的复制与包装所需的各种反式蛋白 ;同时也含有HSV 1tsK病毒 ,它提供AAV 2复制与包装所需的全部辅助病毒功能 .实验结果也表明 ,HSV 1tsK病毒的复制为混合毒种辅助重组AAV载体的包装所必需 .这项研究首次报道了一种全新的重组AAV载体包装系统 ,与传统的双质粒共转染、腺病毒辅助包装方案相比 ,本系统简便易行 ,并明显提高了重组AAV的包装效率 .

单纯疱疹病毒扩增子载体转导的ATM基因在活体的异位表达(英文)

小脑性共济失调与血管扩张症 (A-T)是一种常染色体隐性遗传性疾病 ,具多效表型。此病的特征是小脑变性、免疫缺陷、生长迟缓、早熟性衰老、染色体不稳定、肿瘤易患体质和对辐射的过度敏感。目前尚未发现有效的方法阻断此病的进行性发展。基因治疗是此病的潜在希望。ATM是此病的致病基因 ,编码 ATM蛋白激酶。本研究将 ATM c DNA完整的读码框架克隆进 1型单纯疱疹病毒 (HSV-1)扩增子载体 (p TO-ATM)。培养的 A-T细胞经 p TO-ATM病毒载体转导后 ,用免疫组织化学方法证明了 ATM在这些细胞的异位表达。为了进一步研究在活体应用此载体系统的可能性 ,选择大鼠脑作为实验靶区。先用免疫组织化学方法观察了内源性 ATM在成年大鼠前脑和小脑的正常分布 ,发现在尾壳核有低水平的 ATM出现 ,而在其余脑区 ,ATM水平则显著地高于尾壳核区。将 p TO-ATM病毒载体注射到成年大鼠的一侧尾壳核 ,3 d后在注射区 (包括针道周围的区域 )观察到密集的 ATM免疫反应阳性神经元。本研究结果证明 ,HSV扩增子病毒载体可以稳定地运载相当大的 c DNA片段 ,转基因在离体和活体均能有效地表达。本研究为使用基因治疗的方法治疗

单纯疱疹病毒I型扩增子系列载体的构建

我们先前已报道了构建成一种能在ＨＳＶｔｓＫ株辅助下进行复制和包装，并表达β－半乳糖苷酶基因ｌａｃＺ的ＨＳＶ－１扩增子质粒ｐＨＳＬ，以及它的应用〔１〕。该质粒中依次含有ＨＳＶ－１复制起点ｏｒｉＳ序列及ＩＥ６８启动子、ｌａｃＺ基因、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ＨＳＶ－１包装信号‘ａ’序列和大肠杆菌质粒骨架。然而，该质粒中的报告基因ｌａｃＺ无法用简单的酶切方法卸载下来，继而装入目的基因。本研究在此基础上，新构建了一系列质粒型单纯疱疹病毒载体。首先构建了ＨＳＶ－１扩增子载体质粒ｐＨＳＶＩＥ６８，在ＩＥ６８启动子的下游带有可供外源基因插入的ＨｉｎｄⅢ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ等克隆位点，其后没有ｐｏｌｙＡ加尾信号。为检验ｐＨＳＶＩＥ６８载体的有效性，将报告基因ｌａｃＺ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ片段通过ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨＩ位点插入该载体中，构建成重组扩增子质粒ｐＨＳＶ－ｌａｃＺ１。将该质粒转入ＢＨＫ细胞，并辅以ＨＳＶ－１ｔｓＫ株病毒感染，３１℃培养４８～７２小时后收获的细胞上清感染新鲜的ＢＨＫ细胞，用Ｘ－ｇａｌ液染色可见有大量细胞蓝染，提示所构建的ｐＨＳＶＩＥ６８质粒能有效地工作。在此基础上，我们又构建了含有ＳＶ４０ｐｌｏｙ?

HSV-1 SM44株糖蛋白D基因真核表达载体的构建及其免疫效果观察

目的构建HSV 1型SM44株糖蛋白D(gD)基因的真核表达载体 ,并用此重组质粒直接免疫小鼠 ,探讨HSV 1gD基因作为基因疫苗的可能性。方法从HSV 1基因组中扩增 gD的全编码基因 ,克隆入载体 pUC19中 ,测序鉴定后转入真核表达载体 pcDNA3.1( +)。所得重组质粒pcDNA gD以电穿孔法转染CHO细胞 ,并以荧光染色法鉴定表达效果。用 pcDNA gD免疫小鼠 ,ELISA法检测基因免疫的应答效果。结果成功地构建了可在真核细胞中有效表达的HSV 1gD真核表达载体 ,用其直接免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答。结论 gD的真核表达载体有可能作为HSV 1的基因疫苗 ,为进一步研究基于 gD的表位生物学和表位疫苗奠定了基础。

无辅助病毒HSV-1载体介导LacZ基因在培养皮层神经元中的表达

目的:探讨无辅助单纯疱疹病毒(herpessimplexvirustype 1,HSV 1)载体的包装及其介导LacZ基因在体外培养神经元表达的作用, 解决该载体系统在包装及体外培养神经元应用中的有关问题。方法:将一组含HSV 1基因组的粘粒以限制性内切酶PacⅠ酶切、纯化后,与含LacZ和酪氨酸羟化酶 (tyrosinehydroxylase,TH)及神经微丝(neurofilament,NF)嵌合启动子的HSV 1质粒DNA在脂质体作用下,共转染 2 2细胞;在 34℃条件下培养 72h,收获病毒颗粒。将含病毒颗粒的上清液,加入BHK细胞培养液中,继续培养 24h后,加X gal染液作用 4h,观察表达LacZ基因的蓝染细胞。取培养第 3天的胚胎大鼠大脑皮层神经元,加入含病毒颗粒的培养液,过夜后更换新鲜培养液,分组继续培养 1, 7和 14d,进行X gal染色,光镜下观察。结果:包装形成的病毒颗粒感染BHK细胞, 24h后可见表达LacZ基因的蓝染细胞;感染培养第 3天的皮层神经元,继续培养 1, 7和 14d后均可见蓝染神经元。结论:无辅助病毒包装系统能够使含TH NF嵌合启动子的HSV 1载体形成有效的病毒颗粒,并且在体外培养神经元中持续稳定地表达外源基因,为在神经系统进行基因转移和基因功能研究提供了有效的工具。

HSV-1载体在小鼠及猴体内抗体检测方法的建立

目的为了对以HSV-1为载体的基因工程产品在动物体内药物安全评价检测抗体的需要建立一套ELISA检测方法。方法将重组HSV-1抗原作为包被抗原,对HSV-1抗原的最佳包被稀释度、包被效率、阴性和阳性血清标本的最佳稀释度进行了考察。并根据建立的检测方法,对2种动物(Balb/c小鼠和恒河猴)在给予HSV-1载体后得到的阴性血清(小鼠:30份;恒河猴:24份)和阳性血清(小鼠:120份;恒河猴:96份)进行了血清抗HSV-1抗体检测。结果(1)HSV-1抗原的最佳包被稀释度为1∶800(4.5μg),包被效率为82%;(2)阴性和阳性血清标本的最佳稀释度均为1∶100;(3)用所建立的检测方法,能够较好的在小鼠和恒河猴的阳性血清中检测出抗HSV-1的抗体。结论该方法能全面满足以HSV-1为载体的基因工程产品在药物安全评价中抗体的检测需要,该检测方法的建立能够为该类产品或相关基因工程产品的药物安全评价研究中抗体的检测分析提供一定的参考依据。

HSV-1载体对体外培养神经元感染作用的研究

目的利用重组有lacZ基因的HSV-1假型病毒载体感染体外培养的人胚神经元,(以β-gal组织化学染色来检测报告基因lacZ在神经元中的表达),并观察该载体的细胞毒性及病毒的水平传播情况。方法用重组有lacZ基因的HSV-1扩增子质粒pHSVlac包装成复制缺陷的假型病毒载体,并在Vero细胞中传代增殖,产生高滴度的病毒载体,用其感染体外原代培养的神经元,以β-gal染色观察报告基因lacZ在神经元中的表达及该载体的细胞毒性。结果pHSVlac质粒与HSV-1 17 ts K可在Vero细胞中包装成复制缺陷的HSV-1假型病毒载体,经传代其滴度可达1×108PFU/mL。该载体在37℃时能感染体外原代培养的人胚神经元,并在其中表达LacZ基因,未发现细胞毒性改变。结论HSV-1载体能够高效靶向地将外源基因导入非分裂的神经元,HSV-1载体介导的基因转移系统的建立为进一步开展神经机能及神经系统疾病的基因治疗的研究奠定了基础。

含Ⅰ型单纯疱疹病毒包装信号序列片段的分离及扩增子质粒双表达载体的构建

利用基因工程技术分离出含有Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV－1）包装信号序列和HSV－1基因组复制起点序列的片段，表达外源基因所必需的启动子序列以及其下游作为报告基因的lacZ基因片段，构建成质粒型HSV－1载体pHSVL。用脂质体介导的方法可将该质粒转染入经辅助病毒HSV－1tsK株超感染的Vero细胞，并将其包装成HSV－1假型病毒颗粒，可如天然病毒一样再感染传代细胞和神经细胞并在其中进行基因表达。在pHSVL的基础上，我们还构建了一种可同时表达两种外源基因的质粒型疱疹病毒载体pHLCL，即在pHSVL中插入第二个转录单位：HCMVIE启动子和其下游的荧光素酶基因（lucgene），由此获得的pHLCL病毒接种传代细胞证明它可在其中同时表达两种报告基因．本研究成功地构建了两种质粒型HSV－1载体，其独特的基因转移方式使之在神经生理、病理及神经系统疾病的基因治疗的实验研究中都具有广阔的应用前景。

HSV-1HF株扩增子载体的构建及其在不同HSV血清型间的通用性研究

旨在构建HSV-1HF株的扩增子载体,研究其在不同血清型HSV辅助下的包装通用性。经酶切HF株的BAC-HSV-1,获得oriS和pac元件并测序。以pSilencer2.0-U6为骨架,以DsRed为报告基因构建HSV-1HF株的扩增子载体,利用脂质体2000转染扩增子载体至Vero细胞,分别应用HSV-1HF株和HSV-2HG52辅助HSV-1扩增子载体进行包装,待产生细胞病变效应后取上清,再次感染Vero细胞,观察Vero细胞内红色荧光蛋白表达情况。本研究首次构建了HSV-1HF株的扩增子载体,鉴定了HSV-1HF株oriS和pac元件,HSV-1HF株扩增子载体可以被HSV-1HF株和HSV-2HG52株包装并扩增。

单纯疱疹病毒Ⅰ型基因治疗载体的快速构建

背景:单纯疱疹病毒Ⅰ型载体因具有独特的优点目前被广泛应用,但其构建尚缺乏一种快速有效的方法。目的:利用Cre/Loxp高效重组系统构建单纯疱疹病毒Ⅰ型载体。方法:分离单纯疱疹病毒HSV-1,将含Cre重组酶的c66-SV40-cre质粒转染Vero细胞,构建一株带有Loxp位点的重组HSV-1框架载体HSVLoxp。构建穿梭载体pShuttle-SV40-Cre-Loxp-IRES及重组单纯疱疹病毒Ⅰ型载体HSV-GDNF,用HAT培养基筛选出阳性毒株后用GDNF引物做PCR鉴定,扩增培养后测定滴度。结果与结论:成功构建pHV-TK-GFP质粒,并在Vero细胞内发生重组,分离出缺失了Us3基因的重组病毒HSVtk-Loxp-GFP01。成功构建HSV-1框架载体HSVLoxp及穿梭载体pShuttle-SV40-Cre-Loxp-IRES,成功获得GDNF基因,并将其转移到了HSV-1基因组上,成功构建了表达GDNF的单纯疱疹病毒HSV-1载体,测定其滴度约为2.25×106IU/mL。

四环素调控复制缺陷性疱疹病毒载体介导LacZ基因在原代培养神经元中的表达

目的利用四环素调控复制缺陷性单纯疱疹病毒I型重组载体(QR9TO-LacZ)感染体外原代培养的大鼠皮层神经元,探讨其介导半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达情况及基因调控效能;并检测该载体对神经元活力的影响。方法用RUL9-8细胞系扩增QR9TO-LacZ病毒株,收集后采用噬斑法测定病毒滴度;体外原代培养大鼠皮层神经元。将培养的原代神经元分为强力霉素(DOX)组和对照组。两组细胞均用QR9TO-LacZ转染,强力霉素组加入四环素衍生物强力霉素(0.5μg/ml),对照组加入等剂量空白对照液。同时根据感染复数(MOI),即MOI=3、5、10、30 PFU/cell,将两组培养细胞进一步分为亚组。病毒转染48h后行X-gal染色;光镜下观察神经元形态,随机选取10个高倍镜视野(×400),计算每高倍镜视野中平均蓝染细胞率,比较不同MOI病毒感染神经元的效率。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测感染病毒48 h(MOI同上)后神经元的活性。结果在含有DOX的培养环境中,不同MOI亚组(3、5、10、30 PFU/cell)QR9TO-LacZ感染神经元出现蓝染细胞百分比分别为5.35%±0.84%、10.64%±1.92%、19.73%±2.87%、34.41%±2.58%;在无DOX的培养环境中,各亚组均未观察到蓝染细胞。上述MOI感染的神经元细胞存活率分别为:90.24%±8.16%、88.00%±5.69%、83.95%±3.82%、78.90%±5.49%。结论 QR9TO-LacZ载体能有效地将目的基因导入原代培养神经元中并表达;目的基因表达的开启受强力霉素调控;QR9TO-LacZ对体外原代培养神经元毒性较低。

肝癌选择性溶瘤腺病毒的构建及其体外抑瘤作用

目的:构建由AFP基因增强子-启动子调控,并携带自杀基因TK的新型条件复制型腺病毒载体,观察该载体的选择复制能力、溶瘤作用及其与前药GCV联合处理对肝癌细胞的杀伤作用。方法:以HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增AFP基因启动子(AFPp)和增强子(AFPe),构建表达质粒pAFPp-EGFPluc和pAFPep-EGFPluc,再构建由AFPep调控E1A表达、并携带TK基因的穿梭质粒pDC311-AFPep-E1A/CMV-TK,利用AdMax系统包装腺病毒Ad.AFPep-E1A/CMV-TK;利用Western blotting、病毒增殖测试、细胞病变效应实验、病毒联合前药GCV对肝癌细胞的杀伤实验等鉴定病毒的复制能力、溶瘤作用和对肝癌细胞的杀伤作用。结果:成功构建的腺病毒载体Ad.AFPep-E1A/CMV-TK在AFP阳性细胞中选择性复制,病毒自身具有一定的溶瘤作用;该病毒载体联合GCV前药系统处理肝癌细胞后,AFP阳性肝癌HepG2细胞和Hep3B细胞的存活率分别为(10.35±1.07)%、(15.49±5.80)%,AFP阴性的张氏肝细胞和人肺癌NCIH460细胞的存活率分别为(73.55±4.36)%、(74.54±9.89)%(P<0.01)。结论:构建的新型溶瘤腺病毒载体具有选择性杀伤肝癌细胞的能力,在肝癌治疗方面有良好的应用前景。