携带HSV-1TK基因的逆转录病毒载体构建及在HeLa细胞中的表达

目的:构建携带单纯疱疹病毒脱氧胸腺嘧啶激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)的逆转录病毒,用于宫颈癌的治疗研究。方法:用限制性内切酶从质粒pcDNA3.1/HA-myc-His(-)Z-TK切下HSV-1TK cDNA序列,亚克隆入逆转录病毒载体pLXSN得到重组质粒pLXSN-TK,鉴定正确的阳性重组质粒经PA317细胞包装,G418筛选,在NIH3T3细胞进行病毒滴度测定。然后用病毒感染人宫颈癌细胞HeLa。PCR、RT-PCR和Western blotting方法检测HSV-1TK基因在HeLa中的整合和表达情况。结果:重组质粒pLXSN-TK经PA317细胞包装后收获病毒上清,感染HeLa细胞,检测发现HSV-1TK基因整合到细胞基因组DNA中,并且能有效的转录和翻译。结论:成功构建了逆转录病毒pLXSN-TK,该病毒能有效感染HeLa细胞,并使携带的治疗基因HSV-1TK在细胞中表达,为今后HSV-1TK基因治疗宫颈癌的研究奠定基础。

肝癌选择性溶瘤腺病毒的构建及其体外抑瘤作用

目的:构建由AFP基因增强子-启动子调控,并携带自杀基因TK的新型条件复制型腺病毒载体,观察该载体的选择复制能力、溶瘤作用及其与前药GCV联合处理对肝癌细胞的杀伤作用。方法:以HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增AFP基因启动子(AFPp)和增强子(AFPe),构建表达质粒pAFPp-EGFPluc和pAFPep-EGFPluc,再构建由AFPep调控E1A表达、并携带TK基因的穿梭质粒pDC311-AFPep-E1A/CMV-TK,利用AdMax系统包装腺病毒Ad.AFPep-E1A/CMV-TK;利用Western blotting、病毒增殖测试、细胞病变效应实验、病毒联合前药GCV对肝癌细胞的杀伤实验等鉴定病毒的复制能力、溶瘤作用和对肝癌细胞的杀伤作用。结果:成功构建的腺病毒载体Ad.AFPep-E1A/CMV-TK在AFP阳性细胞中选择性复制,病毒自身具有一定的溶瘤作用;该病毒载体联合GCV前药系统处理肝癌细胞后,AFP阳性肝癌HepG2细胞和Hep3B细胞的存活率分别为(10.35±1.07)%、(15.49±5.80)%,AFP阴性的张氏肝细胞和人肺癌NCIH460细胞的存活率分别为(73.55±4.36)%、(74.54±9.89)%(P<0.01)。结论:构建的新型溶瘤腺病毒载体具有选择性杀伤肝癌细胞的能力,在肝癌治疗方面有良好的应用前景。