HSV-tk/ACV系统基因治疗小鼠黑色素瘤的实验研究

本文首次应用HSV-tk/ACV系统对小鼠黑色素瘤B16进行了基因治疗研究。体外实验证实,转有HSV-tk基因的B16细胞(B16LNTK)对阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)的敏感性显著高于其亲本细胞B16,当B16LNTK与B16以不同比例混合培养时,亲本细胞B16对ACV的敏感性不同程度增高,存在旁观者效应。用B16LNTK接种同系C57BL/6小鼠,经ACV治疗20天后,B16LNTK组小鼠的肿瘤(0.254±0.18cm^3)较对照组B16组的肿瘤(4.43±1.08cm^3)小94％(n=5,双侧t检验P<0.01)。HSV-tk/ACV系统原位基因转移治疗B16荷瘤小鼠效果显著:HSV-tk/ACV治疗组肿瘤14天后较对照组肿瘤小43％(n=5,双侧t检验P<0.05)。结果提示HSV-tk/ACV系统可作为黑色素瘤基因治疗研究的一种有效方法。

阳离子脂质体介导HSV-TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞增殖活性的影响

目的 探讨HSV TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞增殖活性的影响。方法 用阳离子脂质体Lipofectamine将 pCR3 Uni及含HSV TK基因的真核表达载体 pCR3 TK转染至人脑胶质瘤细胞株TJ90 5中 ,筛选出阳性克隆 ,阳性细胞克隆给予ACV(5 0mg/ml) ,72小时后 ,收集玻片 ,进行AgNOR染色。 结果 转染HSV TK基因的细胞 ,在给予ACV后 ,细胞增殖活性明显降低 ,转染 pCR3 Uni和 pCR3 \|TK细胞克隆的AgNOR颗粒数分别为 1 4.3 3和 6.67(P <0 .0 1 )。结论 AgNOR计数是一种操作简便、检测细胞增殖活性的方法 ,为研究HSV

自杀基因HSV-TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞DNA含量的影响

目的 探讨HSV-TK/ACV系统的抗肿瘤机制。方法 将新近克隆并构建的含HSV-TK基因的真核表达载体pCR3-TK,用Lipofectamine转染至人脑胶质瘤TJ905细胞中,给予ACV,用FCM检测了对细胞DNA含量的影响。结果 转染了TK基因的细胞在ACV的作用下,DNA含量下降(分别为109.43和65.81;而对照组分别为109.28和83.24,细胞DNA的合成被抑制。结论 证实了我们克隆的TK基因对人脑胶质瘤的杀伤作用,同时也将HSV-TK/ACV系统的抗肿瘤机制研究推进了一步。

反转录病毒介导基因转移治疗脑肿瘤的安全性研究──Ⅱ.HSV-tk/ACV系统的安全性研究

采用细胞接种、X－gal染色、TK基因的PCR和病理切片观察，分别将PA317／BAG．PA317／TK产病毒细胞注射到动物体内，结果产病毒细胞在动物体内存活期均不超过1个月；产病毒细胞在体内没有形成肿瘤，也没有发现严重的炎症反应；HSV－tk／ACV系统用于动物基因治疗，ACV及其代谢产物没有发现明显的毒副作用和病理改变。说明反转录病毒介导的HSV－tk／ACV系统在动物体内取得了安全的结果。

HSV-TK/ACV系统促肾癌细胞株GRC-1细胞凋亡的实验研究

目的 观察HSV TK/ACV系统对肾癌GRC 1细胞的杀伤作用及旁观者效应。方法 将含不同浓度的肾癌GRC 1/TK细胞与肾癌GRC 1细胞混合培养 ,分为 4组 ,分别含GRC 1/TK细胞 0 %、2 5 %、5 0 %及 10 0 % ,分别用无环鸟苷 6 0 μg/ml进行处理 ,观察细胞形态改变、测定活细胞数并行流式细胞术、电子显微镜检查。结果 实验组与对照组GRC 1细胞均无明显变化 ;含 2 5 %以上GRC 1/TK细胞可观察到明显的杀伤作用 ,并有凋亡峰及凋亡小体形成。结论 HSV TK/ACV系统对肾癌GRC 1细胞具有明显的杀伤作用及旁观者效应 。

p53基因增强恶性胶质瘤HSV-TK/ACV系统疗效的体外研究

目的 :体外研究p5 3基因提高恶性胶质瘤HSV TK/ACV系统自杀基因治疗疗效的可行性。方法 :以腺病毒为载体转导p5 3和HSV TK基因入C6鼠胶质瘤细胞 ,给以不同浓度的ACV ,MTT法监测细胞生存率 ,TUNEL法检测凋亡。评价p5 3基因提高HSV TK/ACV系统治疗胶质瘤的疗效。结果 :p5 3明显提高鼠胶质瘤细胞对HSV TK/ACV的敏感性 ,p5 3联合HSV TK转染C6的ACVID50 (1μg·mL-1)和ID10 0 (10 μg·mL-1)较单独HSV TK转染C6的ACVID50 和ID10 0 提高 10倍 ,并可使C6细胞凋亡增加。结论 :p5 3基因可明显增强胶质瘤HSV

阳离子脂质体介导HSV-TK/ACV基因系统抑制人肺癌生长的实验研究

目的:探讨阳离子脂质体介导的HSV-TK/ACV基因系统治疗人肺癌的实验研究的意义。方法:利用已构建的真核表达质粒pCR3-TK,用阳离子脂质体LipofectAMINE为载体,将pCR3-TK转染Anip973细胞株,然后给予不同浓度的Aciclovir(ACV)。结果:经MTT检测证实转染了TK基因的肺癌细胞对ACV的杀伤敏感性明显提高,FCM检测可以看到凋亡峰的出现,且相应的S期细胞比率增高。结论:HSV-TK/ACV系统对人类肺癌细胞株Anip973具有良好的抑制作用;阳离子脂质体LipofectAMINE对人类肺癌细胞株Anip973安全、低毒,有可能成为基因治疗应用到临床试验的有价值的载体。

HSV-tk/GCV自杀基因系统对喉癌细胞杀伤作用的体外研究

目的 研究逆转录病毒介导的HSV tk/GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤作用。方法 构建携带HSV tk基因的逆转录病毒载体 ,并以该重组逆转录病毒感染人喉癌细胞Hep 2。以G4 18筛选的抗性克隆 (命名为Hep 2 /tk) ,用MTT比色法观察GCV在体外对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。结果 Hep 2 /tk细胞与未转染tk基因的Hep 2 /0、Hep 2细胞相比较 ,三者的生长速度无明显差别。Hep 2 /tk细胞对GCV高度敏感 ,即低浓度GCV(0～ 1mg/L)处理Hep 2 /tk细胞 7d,可将其大部分细胞杀死 ,增加GCV的浓度 (>1mg/L)不能显著增强其对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。 结论 人喉癌细胞Hep 2对HSV tk/GCV系统高度敏感 。

HSV-TK/GCV系统对人肺癌细胞株的杀伤效应

目的 观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV -TK/GCV系统对人肺癌细胞H4 4 6的体外杀伤作用。方法 利用脂质体(lipofectin)将重组逆转录病毒载体pLXSN -TK导入包装细胞PA317,G4 18筛选至抗性克隆出现 ,收获病毒液。加入聚凝胺感染H4 4 6细胞 ,并筛选出含TK基因的H4 4 6细胞。观察GCV对H4 4 6和不同比例混合的H4 4 6、H4 4 6 /TK的杀伤作用及旁观者效应。结果 经电镜及PCR检测证实TK基因已导入PA317、H4 4 6细胞。H4 4 6 /TK细胞对GCV的敏感性明显高于H4 4 6细胞 ;随着TK+ 细胞比例的增加 ,存活率进一步减低 ,提示GCV不仅杀死TK+ 细胞 ,也杀死混合培养的未转导TK基因的H4 4 6细胞 ,表明HSV -TK基因转导的H4 4 6细胞具有明显的旁观者效应。结论 HSV -TK/GCV系统赋予人肺癌细胞对GCV的高敏感性及旁观者效应。

HSV-TK/GCV自杀基因系统对人胰腺癌细胞的作用

目的 运用自杀基因系统HSV TK/GCV治疗人胰腺癌细胞SW1990的实验研究 ,并证实旁观者效应。方法 通过脂质体介导的基因转移方法将含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (her pessimplexvirusthymidinekinasegene ,HSV TK)的复制缺陷型逆转录病毒载体GINaTK导入包装细胞PA317,然后利用细胞产生的假病毒颗粒感染人胰腺癌细胞系SW 1990细胞。在SW 1990 /TK细胞培养物中加入抗病毒前药GCV ,观察GCV对该细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果 实验表明GCV对SW1990 /TK有显著的抑制及杀灭作用 ,同时表现出强烈的旁观者效应。结论 HSV TK/GCV自杀基因系统对胰腺癌细胞有生长抑制及杀伤作用 。

腺病毒介导HSV-tk/GCV系统诱导ScaBER细胞凋亡的实验研究

目的 HSV tk/GCV系统体外诱导膀胱癌ScaBER细胞凋亡的作用 ,探讨其治疗膀胱癌的机制。方法 采用了带有CMV(人巨细胞病毒早期蛋白启动子 )启动子驱动HSV tk基因的重组腺病毒载体 ,体外转染ScaBER细胞后加入不同浓度更昔洛韦 (GCV) ,MTT法检测对癌细胞生长的抑制作用。应用倒置显微镜、荧光显微镜、透射电镜观察细胞凋亡的形态学 ,流式细胞仪定量检测细胞凋亡的查分率 ,琼脂糖凝胶电泳检测DNA断裂片断。结果 当MOI =10 0时 ,MTT法表明HSV tk/GCV系统作用于ScaBER细胞 ,能明显抑制细胞生长 ,呈时间、剂量依赖性。ScaBER细胞的IC50 为 3 2 3mg/L。透射电镜下可见凋亡小体。DNA琼脂糖凝胶电泳呈梯形条带。 结论 HSV tk/GCV系统对细胞有较强细胞毒作用 ,并可以诱导ScaBER细胞凋亡 ,诱导细胞凋亡是其抗肿瘤的主要机制之一。HSV

HSV-tk/GCV系统对NIH3 T3细胞的体外杀伤作用研究

目的 研究HSV tk/GCV系统对NIH3T3细胞系的杀伤作用 ,为与成纤维细胞增殖有关的皮肤病基因治疗提供体外实验依据。方法 应用携带HSV tk基因的重组质粒pPNT tk通过磷酸钙转染传代培养的NIH3T3细胞 ,并经G418筛选 ,获得抗药性细胞集落 ,利用MTT法检测不同浓度GCV对NIH 3T3细胞的杀伤作用。结果 GCV对NIH3T3 /tk细胞有明显的细胞毒性作用 ,当GCV浓度为 10 .0 μmol/L时 ,NIN3T3 /tk细胞的生存抑制率已高达 95 %以上。而在同样药物浓度条件下 ,未转染的对照NIH 3T3细胞的生存抑制率为 11.9% ,与空白对照组相比较 ,差异无显著性。结论 HSV tk/GCV系统对NIH3T3细胞有很好的抑制作用 ,转染后细胞较之未转染细胞对前体药物更昔洛韦的敏感度显著增加 ,且呈剂量依赖性。

HSV-tk基因/GCV系统治疗肿瘤的旁观者效应与缝隙连接关系的研究

目的 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk）基因／丙氧鸟苷（GCV）系统杀伤肿瘤细胞时旁观者效应与细胞间缝隙连接的关系。方法 用PA317细胞包装STK质粒（逆转录病毒载体介导的HSV-tk基因），形成假逆转录病毒颗粒，转染有缝隙连接的大鼠胶质瘤细胞C6和无缝隙连接的入宫颈癌细胞 Hela，制成 C6 tk+和 Helatk+细胞，将不同比例的C6和 C6 tk+、Hela和 Hela tk+细胞混合，每种比例8孔，培养 24h后 4孔加入含0．5μg/mlGCV的培养基，4孔作对照，6d后用MTT法测量细胞存活率。在两个培养皿中放入周围粘有33mm高滤纸的载玻片，分别接种 C6、C6 tk+细胞。细胞 80%汇合后将载玻片互换，并加入含0．5μg/ml GCV的培养基，6d后观察细胞形态。结果C6细胞组存在旁观者效应，Heal细胞组不存在旁观者效应。培养皿中tk+细胞大部分被杀死,tk-细胞无变化。结论HSV-tk基因/GCV系统杀伤肿瘤细胞时旁观者效应与细胞间缝隙连接有关。

HSV-tkGCV系统联合重组人TNF-α治疗脑胶质瘤的离体实验研究

目的 探讨HSV tk GCV系统联合rhTNF α抗脑胶质瘤的有效性。方法 利用重组HSV tk逆转录病毒载体转染大鼠C6细胞得到HSV tk阳性细胞 ,C6 GCV、C6+tk GCV、C6+rhTNF α和C6+tk GCV +rhTNF α4组在体外分别给予GCV或 和rhTNF α处理 ,用MTT法测量细胞存活率 ,比较各组肿瘤细胞存活率。卡方检验作显著性检测。结果 未加任何抗癌因子处理的C6细胞组肿瘤细胞生长旺盛 ,细胞形态无明显改变 ;各处理组的肿瘤细胞 2～ 3天后开始逐渐出现细胞突触消失 ,细胞变圆 ,胞体皱缩 ,核仁固缩、裂解、甚至消失 ,继而逐渐死亡。联合应用HSV tk GCV +rhTN α组的肿瘤细胞存活率比单纯应用HSV tk GCV组或rhTNF α组明显低 (P <0 0 5)。结论 :联合应用HSV tk GCV系统和rhTNF α的杀癌细胞效果优于单一使用HSV tk GCV系统或者rhTNF α。

肝癌HSV-tk/ACV基因治疗的实验研究

目的 :观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV - tk基因 ,自杀基因 )与阿昔洛韦 (ACV)系统对人肝癌细胞的体外杀伤效果。方法 :体外培养已感染含 HSV- tk基因的重组逆转录病毒的 PA317- tk细胞 ,获取含 HSV- tk基因的重组逆转录病毒颗粒。用后者感染人肝癌细胞株 SMMC- 772 1,G418培养基筛选抗性克降 SMMC- 772 1- tk,并以 PCR技术检测 HSV- tk基因判断转染成功与否。用形态学方法和 MTT法检测 ACV对 SMMC- 772 1- tk细胞的杀伤作用。结果 :SMMC- 772 1- tk细胞经 PCR证实含 PCR- tk基因。形态学观察显示 ,ACV浓度在 0 .0 1～ lμg/ ml时 ,SMMC- 772 1- tk细胞小部分死亡 ,在浓度自 1μg～ 10 0 0μg/ m l时 ,细胞大部分死亡 ;HE染色可见细胞凋亡。MTT法测定显示 ,ACV浓度自 1μg/ ml开始即对 SMMC- 772 1- tk细胞产生明显抑制作用 ,抑制率自 49%到 78% ,作用强度呈 ACV浓度依赖性。各种浓度的 ACV对 SMMC- 772 1细胞没有或只有轻度抑制作用。结论 :HSV- tk/ACV系统体外对肝癌细胞有明显的杀伤作用 ,有可能成为临床基因治疗方案。

阳离子脂质体介导HSV-TK基因对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用

目的 观察阳离子脂质体介导的HSV TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法 将新近克隆的含HSV TK基因的真核表达载体pCR3 TK ,用阳离子脂质体Lipofectamine转染至人脑胶质瘤细胞株TJ90 5中 ,筛选出阳性克隆 ,给予不同浓度的ACV ,观察不同时间对细胞的杀伤情况 ,并用MTT方法检测不同细胞对ACV的反应情况。结果 转染TK基因的胶质瘤细胞对ACV的杀伤敏感性明显提高 (P <0 .0 1 ) ,ACV对转染TK基因的胶质瘤细胞有特异性抑制和杀伤作用。结论 阳离子脂质体Lipofectamine是一种简便、安全、有效的基因转移方法。可用阳离子脂质体介导pCR3 TK转移 ,进行胶质瘤HSV TK/GCV基因治疗的研究 。

HSV-TK自杀基因对涎腺多形性腺瘤细胞治疗的实验研究

目的研究单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)/丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)系统对人涎腺多形性腺瘤体外基因治疗的作用。方法采用腺病毒包装重组脂质体介导的含有HSV-TK全长的cDNA真核表达质粒PDC312-HSVTK转染人涎腺多形性腺瘤细胞,通过RT-PCR检测TK基因在转染细胞中的表达;用MTT法检测HSV-TK/GCV系统对多形性腺瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应;采用倒置显微镜、组织学染色等观察HSV-TK/GCV系统作用细胞后的形态学改变。结果HSV-TK基因转染24 小时后,肿瘤细胞开始出现空泡性变;转染48小时后,RT-PCR从转染的细胞中成功扩增出1150bp的特异性TK 基因片段。转染36小时后加入不同浓度的GCV治疗,细胞出现核固缩,胞浆裂解,随之细胞死亡、脱壁的现象。细胞存活率随HSV-TK/GCV作用时间延长而逐渐下降,当加入10-4mol/LGCV治疗7天时,HSV-TK/GCV系统的杀伤作用最强,细胞存活率为10.3%。当TK阳性的细胞占细胞总数50%时,其旁观者效应最明显,细胞存活率为31.7%。结论HSV-TK/GCV系统对涎腺多形性腺瘤细胞具有明显的杀伤作用和旁观者效应。

腺病毒介导HSV—TK/GCV系统联合放射治疗口腔鳞癌的研究

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对放射治疗的增敏作用。方法口腔鳞癌细胞(Tca8113细胞系)经HSV—TK/GCV系统治疗后给予放射治疗,采用LQ和单击多靶(SHMT)模型分析细胞存活曲线参数。结果细胞存活曲线分析显示:单纯放射治疗组其α为0.1074,β为0.0158,D0为2.2576,Dq为3.5413;与单纯放射治疗组比较,HSV—TK/GCV治疗组α(0.2127)和α:β(9.496)值大,D0(1.4526)和Dq(2.2257)值小,其放射增敏率(SER)为1.55。结论HSV—TK/GCV系统具有放射增敏作用,可提高放射治疗对口腔鳞癌的治疗疗效。