HSV1-tk基因的部分DNA序列分析

采用PCR技术从商品质粒pHSV10 6扩增出HSV1 tk基因 (112 8bp) ,PCR产物用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3,然后以重组质粒pcTK为模板 ,tk基因的 5′端引物为DNA测序引物进行部分DNA序列分析 .部分DNA序列分析证明PCR产物为HSV1 tk基因正确无误 ,成功筛选到HSV1 tk基因的真核表达载体pcTK 。

绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建及活性检测

【目的】构建绿色荧光蛋白(GFP)示踪的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组慢病毒载体,并检测该系统对人皮肤黑色素瘤细胞株A375的感染活性。【方法】构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒表达载体p LV-tk-GFP,并使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定;用该重组质粒与辅助质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染A375,以嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株;使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,更昔洛韦(GCV)杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。【结果】重组质粒p LV-tk-GFP经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,tk基因已连接到载体正确位置,序列无突变;包装病毒并感染细胞后,荧光显微镜下观察显示tk-GFP基因在A375中表达;筛选得到稳定表达细胞株A375/tk-GFP,GCV能显著杀伤A375/tk-GFP细胞,表明tk基因活性正常。【结论】成功构建了重组p LV-tk-GFP慢病毒载体,该载体能包装产生活病毒且在感染的人黑色素瘤细胞株A375中tk-GFP具有生物活性。

HSV1-TK自杀基因系统对小鼠肝癌细胞移植瘤的抑制效应

目的:构建表达单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组逆转录病毒,建立HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统并检测其对小鼠肝癌细胞H22移植瘤的抑制效应.方法:构建携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pLXSN-tk,用PolyFectTransfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67,通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将该重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞H22,以G418筛选的抗性克隆(命名为H22/tk);将H22/tk细胞与未经基因修饰的H22细胞按1:4混合接种小鼠皮下,联合应用GCV,观察其抑瘤作用(n=19).结果:经酶切鉴定和DNA序列测定,证明HSV1-tk基因成功定向插入到pLXSN逆转录病毒载体中;重组病毒DNA转染包装细胞PT67,获取病毒滴度为4×107cfu/L的重组逆转录病毒培养液;感染小鼠肝癌细胞H22后再筛选出G418抗性克隆株H22/tk.H22/tk细胞与H22细胞混合所致荷瘤鼠在GCV治疗前,各组间肿瘤体积无显著性差异;GCV治疗后,与对照组相比,GCV治疗组肿瘤的生长明显受到抑制,到第8,10,12,14d,致瘤模型对照组的肿瘤体积分别为356±205,635±382,963±580,1509±1105mm3,而GCV治疗组分别为231±155(VS对照组,t=-2.25,P=0.03),413±252(vs对照组,t=-2.14,P=0.04),592±420(vs对照组,t=-2.38,P=0.02),939±847mm3(vs对照组,t=-1.92,P=0.06),GCV治疗组的肿瘤生长抑制率分别为35.0%,35.0%,38.5%,37.8%.结论:成功获取表达HSV1-tk基因的逆转录病毒,已建立显示出体内抑瘤活性的自杀基因治疗系统,为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础.

HSV1-TK基因原核表达载体的构建及表达检测

探讨自杀基因HSV1-TK原核表达情况,为进一步将细菌载体应用于肿瘤基因治疗奠定基础。首先以质粒pHSV-106为模板,通过PCR获得HSV1-TK基因克隆并将其与原核表达载体pGEX-6P-1连接,重组质粒经鉴定后将其转化到E.coli BL21,观察其蛋白表达情况。结果表明,TK基因全长1 128 bp,与理论值相符。经测序发现插入到载体pGEX-6P-1上的DNA片段与TK基因的同源性为100%;SDS-PAGE可明显看出大小为41 ku的TK酶表达,并随时间的延长表达量不断增加。试验证明来源于单纯疱疹病毒的胸苷激酶能够实现原核表达,这一结果是应用细菌载体携带自杀基因TK治疗肿瘤的前提。

Tat蛋白转导结构域介导HSV1-TK导入肝癌细胞及其效应

目的：探讨HIV-1编码的反式激活蛋白Tat与HSV1-TK融合表达对肝癌细胞的杀伤效果。方法：合成编码HIV-Tat47-57（Tat 11）的2条寡核苷酸单链，两端分别引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两个酶切位点，退火形成寡核苷酸双链，15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判断退火效果；以r-pAs16Dr为模板，通过PCR扩增HSV1-TK基因，定向克隆至原核表达载体pET-32中。将含pET-32c-Tat 11-TK的BL21菌通过IPTG诱导表达，表达产物用Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化，免疫组化分析重组蛋白Tat 11-TK的膜结合特性，蛋白印迹技术分析该融合蛋白的穿膜能力，检测和分析TK／GCV、Tat 11-TK／GCV对肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。结果：表达产物SDS-PAGE在相对分子质量60700左右显示条带，符合Tat 11-TK与表达标签融合蛋白的理论值，并证明以包涵体的形式表达；通过Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化获得的Tat 11-TK重组融合蛋白，经免疫组化证实能结合到肝癌细胞表面，蛋白印迹结果说明Tat 11-TK能有效穿过细胞膜进入HepG2细胞内，同时应用低浓度前药更昔洛韦（GCV，150 μmol／L）能有效抑制HepG2细胞生长。结论：Tat 11-TK在原核系统获得高效表达，具有较强的穿膜能力和前药酶活性。

HSV_1-TK基因原核表达质粒的构建及其表达检测

目的:构建含有HSV1-TK基因的原核表达质粒,并对其原核表达情况进行检测,为进一步将细菌载体应用于肿瘤基因治疗奠定基础。方法:以质粒pHSV-106为模板,利用PCR获得HSV1-TK基因克隆并将其与表达载体pBV220连接,重组质粒经鉴定后转化到大肠杆菌DH5α中,并检测其蛋白表达情况。结果:TK基因全长1 128bp,与理论值相符。经测序发现,克隆的DNA片段与TK基因(NCBI登录号:V00470)同源性为100%;但是电泳结果中不能看到目的蛋白条带;因此,进行多次重复及更换宿主等试验以排除试验误差和偏爱密码子的影响;通过更换载体pET-28a确定来源于单纯疱疹病毒的胸苷激酶能够实现原核表达,表达蛋白大小约为41 kD,与理论值相符。结论:试验结果表明HSV1-TK基因能够实现原核表达,筛选合适的TK基因原核表达载体是利用细菌载体携带自杀基因TK治疗肿瘤的基本前提。

HSV_1-TK/GCV系统作为肿瘤疫苗“死亡开关”的研究

背景与目的:肿瘤活疫苗有高效的抗肿瘤免疫能力,但其体内增殖性限制了进一步的临床应用。本研究将Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶/丙氧鸟苷(HSV1鄄TK/GCV)系统作为肿瘤活疫苗的“死亡开关”,以期控制疫苗在体内的存活状态,并探讨其作用机制。方法:以逆转录病毒为载体将HSV1鄄TK基因转导入大鼠卵巢癌细胞株NuTu鄄19,经G418筛选出阳性克隆后与Fischer344大鼠骨髓来源的树突细胞融合,制成携带有HSV1鄄TK基因的卵巢癌DC活疫苗(FC/TK)。以RT鄄PCR和Westernblot检测FC/TK细胞中的HSV1鄄TK表达。体外以XTT法检测不同浓度GCV对FC/TK的体外杀伤作用;以流式细胞仪和Hoechst染色法检测GCV作用5天后FC/TK的凋亡现象。体内实验中,取大鼠经足垫皮下接种FC/TK后分为两组:FC/TK+GCV组大鼠再予GCV腹腔注射7天;FC/TK+生理盐水组作为对照组。接种FC/TK后观察90天,记录注射部位有无肿瘤形成及各脏器的肿瘤转移情况。结果:FC/TK中有HSV1鄄TK的表达,在体外GCV对FC/TK的杀伤率可达86.25%,其中大于80%的FC/TK发生凋亡,并出现细胞核浓缩、边集等凋亡现象。FC/TK+生理盐水组共有3只(60%)的大鼠注射部位出现低分化腺癌;而FC/TK+GCV组未见局部肿瘤形成及脏器转移。结论:HSV1鄄TK/GCV通过诱导肿瘤活疫苗发生凋亡而起到控制其存活状态的作用。

超声微泡介导HSV1-TK／GCV自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用

目的观察超声微泡（UM）介导HSV1-TK／GCV自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤效率。方法将HepG2接种在培养板中，随机分为以下5组：（A）空白对照组；（B）单纯质粒组；（c）超声微泡＋质粒组；（D）超声＋质粒组；（E）超声＋超声微泡＋质粒组。转染后24h，荧光显微镜观察各组细胞绿色荧光的表达，流式细胞仪检测各组细胞的转染效率，噻唑蓝（MTT）比色法检测转染方法对HepG2活性的影响，Westernblot法检测各组细胞的TK蛋白表达；转染后24h，各组细胞加入0．0．1、1．0、10．0、50．0、100．0、500．0、1000．0mg／L共8个浓度梯度的前药更昔洛韦（GCV），72h后MTY法检测各组细胞的存活率。结果荧光显微镜下E组的绿色荧光强度明显高于其他各组；流式细胞仪检测基因转染率分别为0％、0．39％、0．61％、1．10％、36．00％，荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测提示E组tkmRNA相对表达量为1．13，是其余各组的7～9倍，Westernblot条带灰度分析显示E组TK蛋白的明显高于其他各组（P〈0．05）；转染方法对HepG2细胞活性无明显影响（P〉0．05）；GCV浓度在50mg／L以上培养72h后，低频超声＋超声微泡＋质粒组细胞几乎全部被杀灭，存活率为0，杀伤效应最强（P〈0．05），其余各组几乎无杀伤作用。结论超声破坏微泡造影剂可提高HSV1-TK基因在HepG2中的转染和表达，增强HSV1-TK／GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤效应，而超声辐照和微泡造影剂在转染过程中对细胞的活性无影响。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应研究

目的 研究单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV1 TK)基因转染并联合抗病毒药更昔洛韦 (Ganciclovir ,GCV)对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应。方法 采用基因工程技术构建带HSV1-TK基因的逆转录病毒重组体pLX SN TK ,采用脂质体介导入PA317包装细胞 ,建立重组逆转录病毒载体分泌细胞株PA317 TK ;用该细胞上清液转导人胶质母细胞瘤细胞 ,用不同浓度GCV作用人胶质母细胞瘤细胞SW0 38 C2 TK和野生型SW0 38 C2 ,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测 72h后细胞存活率 ,并求出半杀伤浓度。结果 重组逆转录病毒载体pLXSN TK能有效地将TK基因导入SW0 38-C2细胞内 ,并使其获得对GCV的敏感性 ;体外细胞毒实验 :在 2 0 μmol LGCV存在的情况下 ,野生型细胞无明显改变 ,而实验组细胞明显死亡 ,半杀伤浓度IC50 为 0 8μmol L ,与SW0 38 C2相比 ,对GCV的敏感性提高了 6 0 0倍 ,旁杀效果也较明显。结论 SW0 38 C2转染TK基因后 ,能有效地被GCV杀灭。