自杀基因系统HSV1-TK/GCV对MEC-1细胞的体外杀伤及诱导凋亡作用

目的 :探讨HSV TK/GCV系统对MEC 1细胞的体外作用。方法 :用脂质体介导将含有HSV 1 TK全长cDNA的真核表达质粒G1NATK转染人黏液表皮样癌细胞系MEC 1,经G418筛选 ,挑选阳性克隆 ,用PCR及RT PCR检测目的基因的整合及mRNA转录 ;分别用MTT及细胞记数法检测TK阳性细胞对GCV的体外敏感性及旁观者效应 ;用倒置显微镜、HE染色、活细胞荧光染色及TUNNEL染色观察GCV作用下MEC 1/TK的形态学变化。结果 :PCR及RT PCR分别从G418阳性克隆中成功扩增出 40 4bp的特异性基因片段 ,将此G418抗性克隆命名为MEC 1/TK ;IC50 MEC 1/TK为 0 .7μg/ml,而MEC 1为 10 0 0 μg/ml以上 ;当将TK阳性细胞和TK阴性细胞以不同比例混合 ,TK阳性细胞只占 10 %时 ,即有 90 %的细胞被杀死 ;形态学观察表明 ,经GCV作用 ,MEC 1/TK细胞变圆、脱壁、漂浮 ,部分细胞呈现核浓缩、核碎裂等特征 ,TUNNEL染色核阳性着色细胞明显增多。结论 :HSV TK/GCV系统在体外能明显杀伤MEC 1细胞 ,对GCV的敏感性比未转染的亲本细胞提高 10 0 0倍以上 ,并显示较强的旁观者效应 ;GCV可诱导部分MEC

大鼠肝癌细胞HSV-tk/GCV自杀基因系统的构建及其旁观者效应

目的:构建针对大鼠肝癌细胞的HSV-tk/GCV(以下简称tk/GCV系统)自杀基因治疗系统,建立比较tk/GCV系统作用效果及其旁观者效应大小的细胞模型和检测方法.方法:用包装细胞PT67/tk分泌的重组逆转录病毒的活性颗粒感染大鼠肝癌CBRH7919细胞,用G418筛选3wk获得高耐药性的重组子CBRH7919/tk,扩大培养.提取CBRH7919(tk-),CBRH7919/tk(tk+)细胞的DNA,把HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后,与2种DNA及阳性对照DNA进行点杂交,以检测tk+细胞的DNA是否整合有HSV-tk基因.用0.1、1、10、50、100mg/L的GCV体外作用于tk-、tk+细胞,MTT检测存活率.用GCV体外分别作用于含不同比例tk+细胞的tk+、tk-混合细胞,MTT检测存活率,比较分析各组旁观者效应大小,确定后续实验的合适tk+比例.结果:用G418筛选3wk后获到高耐药性的CBRH7919/tk(tk+)重组细胞.HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后进行点杂交,检测到tk+细胞DNA上已整合有HSV-tk基因,而tk-细胞DNA不含HSV-tk基因.GCV对tk+细胞生长抑制和细胞毒作用明显,而且有浓度、时间依赖性,而tk-细胞对GCV不敏感,说明HSV-tk基因已表达且表达产物具有生物学活性.GCV对含5%和10%tk+的混合细胞杀伤率分别为6.0%和25.2%,结果表明5-10%的tk+混合比例下自杀基因系统自身的旁观者效应较低,而且用MTT检测旁观者效应大小时灵敏度比较高,可作为后续研究中药活性成分对旁观者效应增效作用的tk+、tk-混合比例.结论:成功构建了针对大鼠肝癌的HSV1-tk/GCV自杀基因治疗系统,建立了体外快速筛选旁观者效应增效药物的稳定有效的细胞模型和检测方法.

HSV-tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应

目的 研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 /更昔洛韦 (herpessimplexvirusthymidinekinase /gancyclovir,HSV tk/GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤 (retinoblastoma ,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制。方法 应用脂质体将pCMV/hytk IRES hrGFP质粒导入HXO Rb44细胞株。用潮霉素筛选出阳性细胞克隆并命名为HXO Rb44/tk。RT PCR鉴定hytk基因在HXO Rb44/tk细胞中的转录结果。比较HXO Rb44和HXO Rb44/tk细胞的形态特征及生长特性。通过MTT法检测GCV对不同比例HXO Rb44/tk和HXO Rb44混合细胞的杀伤作用 (“旁观者效应”)。并通过上清移换实验研究旁观者效应发生的机制。结果 HXO Rb44/tk细胞经RT PCR可检测出 5 30bp的hytk基因片段。HXO Rb44/tk和HXO Rb44细胞的形态特征及生长特性无明显差异。HXO Rb44/tk细胞仅占很低比例时即可观察到明显的旁观者效应 ,而GCV作用的HXO Rb44/tk细胞上清对HXO Rb44细胞无杀伤作用。结论 HSV tk基因转移联合GCV治疗可作为Rb基因治疗的一种有效方法 。

细胞缝隙连接与HSV-TK/GCV系统旁观者效应的关系

在用单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统治疗肿瘤的研究中,一个有趣和重要的现象就是旁观者效应(bystander effect,BE)。它在很大程度上提高了HSV-TK/GCV系统治疗肿瘤的疗效。但到目前为止,BE的确切机制尚未阐明。大量研究表明,靶细胞连接蛋白(connexin,Cx)的表达及其形成的细胞间缝隙连接(gapjunction,GJ)与这一现象关系密切。该文对GJ与HSV-TK/GCV系统BE的关系作一综述,并探讨了由HSV-TK/GCV系统生成可经GJ传递的"死亡信号"的性质。

HSV-TK/GCV自杀基因系统对人胰腺癌细胞的作用

目的 运用自杀基因系统HSV TK/GCV治疗人胰腺癌细胞SW1990的实验研究 ,并证实旁观者效应。方法 通过脂质体介导的基因转移方法将含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (her pessimplexvirusthymidinekinasegene ,HSV TK)的复制缺陷型逆转录病毒载体GINaTK导入包装细胞PA317,然后利用细胞产生的假病毒颗粒感染人胰腺癌细胞系SW 1990细胞。在SW 1990 /TK细胞培养物中加入抗病毒前药GCV ,观察GCV对该细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果 实验表明GCV对SW1990 /TK有显著的抑制及杀灭作用 ,同时表现出强烈的旁观者效应。结论 HSV TK/GCV自杀基因系统对胰腺癌细胞有生长抑制及杀伤作用 。

HSV-tk/GCV自杀基因系统对喉癌细胞杀伤作用的体外研究

目的 研究逆转录病毒介导的HSV tk/GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤作用。方法 构建携带HSV tk基因的逆转录病毒载体 ,并以该重组逆转录病毒感染人喉癌细胞Hep 2。以G4 18筛选的抗性克隆 (命名为Hep 2 /tk) ,用MTT比色法观察GCV在体外对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。结果 Hep 2 /tk细胞与未转染tk基因的Hep 2 /0、Hep 2细胞相比较 ,三者的生长速度无明显差别。Hep 2 /tk细胞对GCV高度敏感 ,即低浓度GCV(0～ 1mg/L)处理Hep 2 /tk细胞 7d,可将其大部分细胞杀死 ,增加GCV的浓度 (>1mg/L)不能显著增强其对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。 结论 人喉癌细胞Hep 2对HSV tk/GCV系统高度敏感 。

HSV-TK/GCV系统对人肺癌细胞株的杀伤效应

目的 观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV -TK/GCV系统对人肺癌细胞H4 4 6的体外杀伤作用。方法 利用脂质体(lipofectin)将重组逆转录病毒载体pLXSN -TK导入包装细胞PA317,G4 18筛选至抗性克隆出现 ,收获病毒液。加入聚凝胺感染H4 4 6细胞 ,并筛选出含TK基因的H4 4 6细胞。观察GCV对H4 4 6和不同比例混合的H4 4 6、H4 4 6 /TK的杀伤作用及旁观者效应。结果 经电镜及PCR检测证实TK基因已导入PA317、H4 4 6细胞。H4 4 6 /TK细胞对GCV的敏感性明显高于H4 4 6细胞 ;随着TK+ 细胞比例的增加 ,存活率进一步减低 ,提示GCV不仅杀死TK+ 细胞 ,也杀死混合培养的未转导TK基因的H4 4 6细胞 ,表明HSV -TK基因转导的H4 4 6细胞具有明显的旁观者效应。结论 HSV -TK/GCV系统赋予人肺癌细胞对GCV的高敏感性及旁观者效应。

乳腺癌特异性多肽介导的HSV-TK/GCV系统的构建及其靶向杀伤效应

目的:研究乳腺癌MDA-MB-231细胞特异性转导多肽PI介导的HSV-TK/GCV抗瘤系统对乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外靶向杀伤作用。方法:以PCR从质粒pORF-HSV-TK中扩增目的基因PI-TK,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET-28a(+)-PI-TK载体,转化宿主菌,经IPTG诱导表达PI-TK融合蛋白,利用His-Tag对其进行纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定PI-TK融合蛋白。将不同质量浓度的PI-TK融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,联合更昔洛韦(ganci-clovier,GCV)作用后,倒置显微镜下观察细胞的形态变化,CCK-8法检测MDA-MB-231细胞的增殖。结果:成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-PI-TK,获得纯化的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE及Western blotting鉴定PI-TK融合蛋白表达正确。单独PI-TK融合蛋白不影响MDA-MB-231细胞的形态和增殖,但PI-TK融合蛋白联合GCV能剂量依赖性靶向抑制MDA-MB-231细胞的增殖,200μg/ml PI-TK+10 mg/LGCV作用的抑制率达(68.9±7.57)%;PI-TK联合GCV抑制MDA-MB-231细胞的IC50值为152.64μg/ml。上述各作用对MDA-MB-435细胞均无影响(P<0.05)。结论:乳腺癌特异性转导多肽PI介导的HSV-TK/GCV抗瘤系统可靶向杀伤MDA-MB-231细胞。

HSV-tk/GCV系统对NIH3 T3细胞的体外杀伤作用研究

目的 研究HSV tk/GCV系统对NIH3T3细胞系的杀伤作用 ,为与成纤维细胞增殖有关的皮肤病基因治疗提供体外实验依据。方法 应用携带HSV tk基因的重组质粒pPNT tk通过磷酸钙转染传代培养的NIH3T3细胞 ,并经G418筛选 ,获得抗药性细胞集落 ,利用MTT法检测不同浓度GCV对NIH 3T3细胞的杀伤作用。结果 GCV对NIH3T3 /tk细胞有明显的细胞毒性作用 ,当GCV浓度为 10 .0 μmol/L时 ,NIN3T3 /tk细胞的生存抑制率已高达 95 %以上。而在同样药物浓度条件下 ,未转染的对照NIH 3T3细胞的生存抑制率为 11.9% ,与空白对照组相比较 ,差异无显著性。结论 HSV tk/GCV系统对NIH3T3细胞有很好的抑制作用 ,转染后细胞较之未转染细胞对前体药物更昔洛韦的敏感度显著增加 ,且呈剂量依赖性。

腺病毒介导HSV-tk/GCV系统诱导ScaBER细胞凋亡的实验研究

目的 HSV tk/GCV系统体外诱导膀胱癌ScaBER细胞凋亡的作用 ,探讨其治疗膀胱癌的机制。方法 采用了带有CMV(人巨细胞病毒早期蛋白启动子 )启动子驱动HSV tk基因的重组腺病毒载体 ,体外转染ScaBER细胞后加入不同浓度更昔洛韦 (GCV) ,MTT法检测对癌细胞生长的抑制作用。应用倒置显微镜、荧光显微镜、透射电镜观察细胞凋亡的形态学 ,流式细胞仪定量检测细胞凋亡的查分率 ,琼脂糖凝胶电泳检测DNA断裂片断。结果 当MOI =10 0时 ,MTT法表明HSV tk/GCV系统作用于ScaBER细胞 ,能明显抑制细胞生长 ,呈时间、剂量依赖性。ScaBER细胞的IC50 为 3 2 3mg/L。透射电镜下可见凋亡小体。DNA琼脂糖凝胶电泳呈梯形条带。 结论 HSV tk/GCV系统对细胞有较强细胞毒作用 ,并可以诱导ScaBER细胞凋亡 ,诱导细胞凋亡是其抗肿瘤的主要机制之一。HSV

腺病毒介导HSV—TK/GCV系统联合放射治疗口腔鳞癌的研究

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对放射治疗的增敏作用。方法口腔鳞癌细胞(Tca8113细胞系)经HSV—TK/GCV系统治疗后给予放射治疗,采用LQ和单击多靶(SHMT)模型分析细胞存活曲线参数。结果细胞存活曲线分析显示:单纯放射治疗组其α为0.1074,β为0.0158,D0为2.2576,Dq为3.5413;与单纯放射治疗组比较,HSV—TK/GCV治疗组α(0.2127)和α:β(9.496)值大,D0(1.4526)和Dq(2.2257)值小,其放射增敏率(SER)为1.55。结论HSV—TK/GCV系统具有放射增敏作用,可提高放射治疗对口腔鳞癌的治疗疗效。

HSV_1-TK/GCV系统作为肿瘤疫苗“死亡开关”的研究

背景与目的:肿瘤活疫苗有高效的抗肿瘤免疫能力,但其体内增殖性限制了进一步的临床应用。本研究将Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶/丙氧鸟苷(HSV1鄄TK/GCV)系统作为肿瘤活疫苗的“死亡开关”,以期控制疫苗在体内的存活状态,并探讨其作用机制。方法:以逆转录病毒为载体将HSV1鄄TK基因转导入大鼠卵巢癌细胞株NuTu鄄19,经G418筛选出阳性克隆后与Fischer344大鼠骨髓来源的树突细胞融合,制成携带有HSV1鄄TK基因的卵巢癌DC活疫苗(FC/TK)。以RT鄄PCR和Westernblot检测FC/TK细胞中的HSV1鄄TK表达。体外以XTT法检测不同浓度GCV对FC/TK的体外杀伤作用;以流式细胞仪和Hoechst染色法检测GCV作用5天后FC/TK的凋亡现象。体内实验中,取大鼠经足垫皮下接种FC/TK后分为两组:FC/TK+GCV组大鼠再予GCV腹腔注射7天;FC/TK+生理盐水组作为对照组。接种FC/TK后观察90天,记录注射部位有无肿瘤形成及各脏器的肿瘤转移情况。结果:FC/TK中有HSV1鄄TK的表达,在体外GCV对FC/TK的杀伤率可达86.25%,其中大于80%的FC/TK发生凋亡,并出现细胞核浓缩、边集等凋亡现象。FC/TK+生理盐水组共有3只(60%)的大鼠注射部位出现低分化腺癌;而FC/TK+GCV组未见局部肿瘤形成及脏器转移。结论:HSV1鄄TK/GCV通过诱导肿瘤活疫苗发生凋亡而起到控制其存活状态的作用。

HSV-tk基因/GCV系统治疗肿瘤的旁观者效应与缝隙连接关系的研究

目的 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk）基因／丙氧鸟苷（GCV）系统杀伤肿瘤细胞时旁观者效应与细胞间缝隙连接的关系。方法 用PA317细胞包装STK质粒（逆转录病毒载体介导的HSV-tk基因），形成假逆转录病毒颗粒，转染有缝隙连接的大鼠胶质瘤细胞C6和无缝隙连接的入宫颈癌细胞 Hela，制成 C6 tk+和 Helatk+细胞，将不同比例的C6和 C6 tk+、Hela和 Hela tk+细胞混合，每种比例8孔，培养 24h后 4孔加入含0．5μg/mlGCV的培养基，4孔作对照，6d后用MTT法测量细胞存活率。在两个培养皿中放入周围粘有33mm高滤纸的载玻片，分别接种 C6、C6 tk+细胞。细胞 80%汇合后将载玻片互换，并加入含0．5μg/ml GCV的培养基，6d后观察细胞形态。结果C6细胞组存在旁观者效应，Heal细胞组不存在旁观者效应。培养皿中tk+细胞大部分被杀死,tk-细胞无变化。结论HSV-tk基因/GCV系统杀伤肿瘤细胞时旁观者效应与细胞间缝隙连接有关。

HSV-tkGCV系统联合重组人TNF-α治疗脑胶质瘤的离体实验研究

目的 探讨HSV tk GCV系统联合rhTNF α抗脑胶质瘤的有效性。方法 利用重组HSV tk逆转录病毒载体转染大鼠C6细胞得到HSV tk阳性细胞 ,C6 GCV、C6+tk GCV、C6+rhTNF α和C6+tk GCV +rhTNF α4组在体外分别给予GCV或 和rhTNF α处理 ,用MTT法测量细胞存活率 ,比较各组肿瘤细胞存活率。卡方检验作显著性检测。结果 未加任何抗癌因子处理的C6细胞组肿瘤细胞生长旺盛 ,细胞形态无明显改变 ;各处理组的肿瘤细胞 2～ 3天后开始逐渐出现细胞突触消失 ,细胞变圆 ,胞体皱缩 ,核仁固缩、裂解、甚至消失 ,继而逐渐死亡。联合应用HSV tk GCV +rhTN α组的肿瘤细胞存活率比单纯应用HSV tk GCV组或rhTNF α组明显低 (P <0 0 5)。结论 :联合应用HSV tk GCV系统和rhTNF α的杀癌细胞效果优于单一使用HSV tk GCV系统或者rhTNF α。

肿瘤HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效策略

HSV-tk/GCV系统是目前应用最广泛的自杀基因治疗系统之一,其重要性日益上升。然而,许多缺陷严重限制了其应用广度和治疗效率。为满足更多领域的研究需要并实现临床治疗,科研人员投入了大量精力改善HSV-tk/GCV系统,增强其治疗效率。增效策略主要包括加强亲和性、提高表达水平、双自杀基因系统联合、诱发免疫系统协同作用、激活细胞周期、与其他肿瘤治疗方法相结合等。本文在阐明HSV-tk/GCV系统的自杀机理的基础上,分析了多种增效策略及效果,列举了应用领域并对未来发展作探讨。

HSVtk/GCV系统体外杀伤大肠癌LoVo细胞的实验研究

目的 观察单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶/丙氧鸟苷(HSV_(tk)+/GCV)系统对大肠癌LoVo细胞的体外杀伤作用,并 研究其作用机理。方法 用逆转录病毒载体介导HSVtk基因转染LoVo细胞获得阳性克隆HSVtk+/LoVo细胞,观察细胞的体外生长情况及GCV对HSVtk+/LoVo细胞的杀伤作用。经光镜、电镜观察细胞的死亡情况。结果 HSVtk+/LoVo细胞体外生长良好。GCV对HSVtk+/LoVo细胞随着浓度和作用时间的增加而增大,通过光镜、电镜观察到细胞的凋亡。结论HSVtk+/GCV系统体外对大肠癌LoVo细胞有强大的杀伤作用,其作用机理与细胞调亡有关。

基于BI-HSV-TK/GCV系统抑制胃癌细胞增殖的作用与机制

目的探讨双歧杆菌-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因-丙氧鸟苷(BI-HSV-TK/GCV)系统对裸小鼠胃癌细胞增殖的抑制效应和分子机制。方法建立裸小鼠胃癌实验模型,检测裸小鼠的体重、肿瘤体积。运用TUNEL法观察裸小鼠胃癌细胞的凋亡情况,运用Western blot实验、RT-PCR实验分别测定胃癌组织中Caspase 3、Caspase 8、Fas及FAP-1蛋白及其mRNA表达情况。结果BI-HSV-TK/GCV系统能够改善裸小鼠的体重,有效抑制其胃癌肿瘤的体积,促进胃癌细胞的凋亡,诱导胃癌细胞凋亡相关基因Caspase 3、Caspase 8、Fas蛋白以及mRNA表达水平增加,FAP-1蛋白以及mRNA表达水平降低。结论BI-HSV-TK/GCV系统能够有效抑制胃癌细胞在裸小鼠体内成瘤的体积,并促进胃癌细胞的凋亡。