20(S)-原人参二醇衍生物对HT1080细胞侵袭转移的影响

检测了所合成的20(S)-原人参二醇衍生物GY1和GY2的抗肿瘤活性.GY1对HT1080、SMMC7721、A549的增殖有显著的抑制作用,呈明显的剂量依赖关系,IC50分别为:35.2±0.9 mg/L,29.6±1.1 mg/L,24.1±1.5 mg/L;而GY2并没有表现出的明显的细胞毒作用,其IC50大于100 mg/L.5 mg/L GY1作用48 h可显著降低HT1080细胞对基底膜成分的粘附和侵袭能力,并对细胞的运动能力有一定影响;而相同浓度的GY2虽然对细胞的粘附性和侵袭性有一定影响,但对细胞的运动性却无明显的影响.

五倍子酸对人纤维肉瘤HT1080细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究五倍子酸(GA)对人纤维肉瘤HT1080细胞增殖和凋亡的影响。方法:分别用3.125、6.250、12.500、25.000、50.000和100.000 mg/L的GA处理HT1080细胞48 h后,应用MTT法检测细胞的抑制率;分别以6.250、12.500和25.000 mg/L的GA作用HT1080细胞48 h后,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,应用免疫细胞化学方法检测GA对HT1080细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。结果:GA对HT1080细胞以剂量依赖的方式抑制其增殖(F=71.214,P<0.001)、诱导其凋亡(F=52.217,P<0.001),并能上调Bax蛋白的表达(F=11.024,P<0.001)、下调Bcl-2蛋白的表达(F=8.741,P<0.001)。结论:GA可能通过上调Bax蛋白的表达和下调Bcl-2蛋白的表达来抑制HT1080细胞增殖和诱导其凋亡。

苦参碱对人HT1080细胞系增殖抑制的体外研究

目的 :研究苦参碱 (Matrine)对人成纤维肉瘤 (HT10 80 )细胞系生长的抑制效应 ,并探讨其作用机制。方法 :用不同浓度的Mat加入体外培养HT10 80细胞中 ,观察加药后细胞生长数量及其形态的变化 ;用MTT法检测Mat的细胞毒作用。结果 :Mat明显抑制HT10 80细胞生长 ;IC50 值为 35 0 μg/ml;其抑制率与药物浓度呈剂量依赖关系。结论 :Mat能有效抑制HT10

RNA干扰MMP-9表达对人纤维肉瘤细胞系HT1080侵袭转移的影响

目的:探讨MMP-9高表达对人纤维肉瘤细胞HT1080侵袭和转移能力的影响,及对相关机制进行初步研究。方法:将能与MMP-9结合的双链RNA转染到HT1080细胞中。结果:人纤维肉瘤细胞HT1080细胞系中的MMP-9表达减少,可导致细胞迁移抑制、增加细胞粘附和减少肿瘤细胞迁移此外,MMP-9敲除后会造成可溶性细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的水平下降,从而导致粘附缺陷与肿瘤转移。结论:MMP-9在人纤维肉瘤细胞HT1080中具有关键作用,通过改变ICAM-1从膜结合形式变为可溶性形式。

人Endostatin cDNA的克隆及其在HT1080细胞中的表达

目的 :构建能表达人Endostatin的真核表达质粒。方法 :设计引物从成人肝cDNA文库中通过PCR扩增到EndostatincDNA ,并在 5′端融合编码人胰岛素信号肽序列 ,经测序证实后连接到真核表达载体pcDNA3.1(- )中。将携带基因的真核表达载体质粒pcDNA3.1(- ) SEND转染HT10 80细胞后用G4 18筛选获得克隆 ,采用RT PCR和West ern blot检测Endostatin的表达。结果 :测序结果表明克隆的人EndostatincDNA完全正确 ,并且在其 5′端融合编码人胰岛素信号肽序列 ;RT PCR显示转染后的HT10 80细胞可以有效地转录EndostatinmRNA ;Western blot检测到转染后的HT10 80细胞上清有相应的蛋白质 ,大小为 2 0kD左右。结论 :含有人胰岛素信号肽序列的人EndostatincDNA重组质粒pcDNA3.1(- ) SEND转染HT10 80细胞后可以有效的表达目的蛋白并能分泌到细胞外 。

基于超高效液相色谱-质谱联用的代谢组学技术对人纤维肉瘤HT1080细胞铁死亡代谢特征的分析

目的:利用代谢组学筛选铁死亡生物标志物,为铁死亡机制探究提供新思路。方法:以HT1080细胞为研究对象,采用细胞活性实验筛选RSL3的染毒条件。利用基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱的代谢组学技术对RSL3处理的铁死亡诱导组、RSL3和Fer-1共同处理的铁死亡抑制组以及溶剂对照组进行非靶向代谢组学检测,结合主成分分析、偏最小二乘法判别分析、正交偏最小二乘判别分析比较各组间代谢谱的差异,筛选差异代谢物,并对得到的差异代谢物进行代谢通路分析。结果:选择1.000μmol/L的RSL3作用6 h用于实验。共筛选出7-酮基胆固醇、维生素D3、植烷酸等60个铁死亡相关差异代谢物,并发现甘油磷脂代谢、鞘脂类代谢、谷胱甘肽代谢等通路与HT1080细胞铁死亡密切相关。结论:筛选出的差异代谢物有望作为铁死亡的潜在生物标志物,为进一步探讨铁死亡机制提供线索。

异红藻糖苷对HT1080肿瘤细胞侵袭转移作用的影响

【目的】分析异红藻糖苷(D-Isofloridoside,DIF)对HT1080肿瘤细胞侵袭转移作用的影响。【方法】用MTT法检测细胞存活率,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,明胶酶谱实验检测细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的活性,Western blot法检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白的表达情况,ELISA法检测血管内皮生长因子(VEGF)的释放量,分子对接预测DIF与MMP-2、MMP-9和HIF-1α蛋白的相互作用。【结果】MTT和划痕实验表明DIF对HT1080细胞无明显毒性作用(P>0.05),且能极显著降低肿瘤细胞的体外迁移能力(P<0.01);与对照组相比,随着实验组DIF浓度增加,MMP-2和MMP-9的活性以及HIF-1α和VEGF蛋白的表达极显著减少(P<0.01)。分子对接预测结果表明,DIF与MMP-2、MMP-9和HIF-1α均能形成稳定的氢键,具有相互作用的可能性。【结论】DIF可明显抑制HT1080肿瘤细胞的MMP-2、MMP-9、HIF-1α和VEGF蛋白的表达,表现出很好的抑制肿瘤细胞迁移的活性。

喹诺酮类化合物H25抗肿瘤侵袭活性体外研究

目的研究喹诺酮类化合物H25抗肿瘤细胞侵袭转移的活性,初步探讨其作用机制。方法明胶酶谱法验证H25对Ⅳ型胶原酶的竞争性抑制作用。MTT法检测H25对HT1080细胞的生长抑制作用。TranswellTM侵袭小室试验检测H25对HT1080细胞侵袭转移的抑制作用。明胶酶谱法和RT-PCR法检测H25对MMP-2、MMP-9表达水平的影响。细胞粘附试验观察H25对HT1080细胞粘附作用的影响。结果 H25能竞争性抑制Ⅳ型胶原酶的水解酶活性。5h和48h药物处理条件下,H25对HT1080细胞生长抑制作用的IC50分别为13.51和1.311μmol/L。TranswellTM侵袭小室试验中,H25对HT1080细胞侵袭Matrigel的抑制率分别为49.1%(1μmol/L,5h)、25.9%(0.1μmol/L,5h)、69.4%(0.1μmol/L,48h)、39.6%(0.01μmol/L,48h),其有效抑制浓度低于细胞生长抑制浓度。明胶酶谱分析证明,H25处理过的HT1080细胞培养上清中Ⅳ型胶原酶活性明显降低。但RT-PCR分析未检测到MMP-2、MMP-9mRNA表达水平的变化。另外,1μmol/L的H25能抑制HT1080细胞的异质粘附作用。结论 H25能有效抑制HT1080细胞的侵袭,不仅因为H25是Ⅳ型胶原酶的竞争性抑制剂,而且可能与其对MMP-2、MMP-9表达的转录后抑制和异质粘附抑制相关。

rAAV-hBMP2-GFP载体感染滴度测定方法的建立

目的建立携骨形态发生蛋白2基因的重组腺相关病毒载体(rAAV-hBMP2-GFP)感染滴度测定的方法,并制备高滴度的rAAV-hBMP2-GFP病毒液,为进一步实验hBMP2诱导大鼠牙槽骨骨缺损修复的基因治疗提供有利的工具。方法通过分析腺相关病毒-HT1080(AAV-HT1080)细胞接种量、培养时间及病毒吸附时间等参数,建立应用荧光计数法测定rAAV-hBMP2-GFP病毒感染滴度的方法,并分析其精密性及检测病毒的稳定性。结果 AAV-HT1080细胞的最佳接种浓度、培养时间及病毒吸附时间分别为3×105个/孔、24h及48h,在此条件下收获的病毒液的感染滴度最高可达3.82×1011/ml,所建立的荧光计数检测方法精密性较好。制备的病毒液的平均感染滴度为3.60×1011/ml,4℃和37℃保存7d及反复冻融5次,稳定性良好。结论建立了rAAV-hBMP2-GFP感染滴度的测定方法,并制备了高滴度及滴度稳定的rAAV-hBMP2-GFP病毒液。

左旋棉酚联合低浓度阿霉素诱导纤维肉瘤细胞凋亡及其机制

目的研究左旋棉酚联合低浓度阿霉素(ADM)诱导纤维肉瘤HT1080细胞凋亡及其作用机制。方法采用噻唑蓝(MTT)检测药物对细胞的抗增殖作用,应用瑞氏-姬姆萨(WG)染色、赫斯特33258(hoechst 33258)染色、透射电镜观察细胞的形态学变化,流式细胞仪检测细胞的凋亡率和细胞周期。蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测Bcl-2、Bax蛋白的表达,比色分析法检测细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-9的活性变化。结果左旋棉酚与低浓度ADM对HT1080细胞具有抑制增殖作用,联合应用作用增强,有浓度与时间依赖性。药物作用后出现细胞凋亡的特征性改变,琼脂糖凝胶电泳观察到梯状带型,流式细胞仪检测发现两药能诱导肿瘤细胞凋亡,联合应用更强。左旋棉酚使细胞阻滞于G1期,ADM使细胞阻滞于S期,联合应用S期的细胞明显增加。细胞内Bcl-2蛋白表达减少,Bax蛋白表达增多,同时出现caspase-9、caspase-3的相继活化,联合应用变化更加明显。结论左旋棉酚与低浓度ADM对纤维肉瘤HT1080细胞有明显抑制增殖及诱导凋亡的作用,联合应用作用加强。

金属蛋白酶抑制剂对外源Rac1表达介导的细胞侵袭胶原屏障的影响

目的体外研究金属蛋白酶(MMPs)抑制剂对外源Rac1基因表达介导的HT1080纤维肉瘤细胞侵袭胶原屏障的影响。方法分别转染显性负调控突变体Rac1V12N17(HN)、持续活化型Rac1V12(HV)或空载体(HW)于纤维肉瘤HT1080细胞,G418筛选。蛋白印迹分析检测外源性Rac1基因表达,并在含胶原蛋白凝胶的3D基质中培养,用得克萨斯红结合的鬼笔环肽染色显示细胞肌动蛋白骨架构型。在含胶原蛋白凝胶覆盖滤膜的Transwell小室进行细胞侵袭胶原屏障实验,并观察MMPs抑制剂和抑肽酶对上述细胞侵袭实验的影响。结果HV细胞伸出明显的突起,HN细胞形态紧凑,HV细胞侵袭胶原屏障的能力大于HW细胞,而后者又强于HN细胞,这种差别在应用广谱MMPs抑制剂后消失,而抑肽酶则无影响。结论外源活化型Rac1基因在纤维肉瘤HT1080细胞内稳定表达可诱发肌动蛋白纤维聚集,并可增加HT1080纤维肉瘤细胞侵袭胶原屏障的能力,但这种细胞侵袭胶原蛋白能力的增强可被MMPs抑制剂阻断。

ECRG2基因对人类纤维肉瘤HT1080细胞侵袭迁移能力的影响

目的探讨ECRG2基因在人类纤维肉瘤侵袭和转移过程中的作用。方法应用RNA干扰技术抑制内源性ECRG2基因在人类纤维肉瘤HT1080细胞中的表达，建立ECRG2基因在该细胞中的可诱导表达系统，Westernblotting方法观察细胞ECRG2蛋白表达水平的变化，细胞划痕实验和Transwell侵袭实验观察HT1080细胞迁移、侵袭能力的变化。结果Westernblotting检测筛选得到敲除内源性ECRG2基因的最佳Tet—On可诱导表达克隆。细胞划痕实验和Transwell侵袭实验发现，敲除内源性ECRG2基因明显促进HT1080细胞的侵袭迁移能力，而表达外源ECRG2基因的HT1080细胞侵袭、迁移能力显著下降。结论ECRG2基因与人类纤维肉瘤的侵袭转移潜能相关，外源ECRG2基因的表达可明显抑制人类纤维肉瘤HT1080细胞的侵袭、迁移能力。

三氧化二砷对纤维肉瘤细胞放射增敏作用的研究

目的研究和探讨三氧化二砷(As_2O_3)是否对纤维肉瘤细胞有放射增敏作用。方法以人纤维肉瘤细胞HT1080为实验对象,首先检测As_2O_3的单药毒性,确定IC_(10)、IC_(50)和IC_(90)。放射增敏作用的实验分为空白对照组、单纯给药组、单纯照射组(包括1、2、4、6、8、10Gy剂量)、照射前加药组(于照射前24h加入设定浓度的As_2O_3,药物作用24h后进行照射)和照射后加药组(于照射后即刻加入设定浓度的As_2O_3,药物作用24h)。所有实验均重复3次。采用克隆形成分析法观察单纯照射和照射联合As_2O_3对细胞的杀伤作用。计算细胞的存活分数,用多靶单击模型进行拟合并做图。结果HT1080细胞的IC_(10)、IC_(50)和IC_(90)剂量分别为0．57、3．67和12．0μmol/L。无毒剂量的As_2O_3照射前给药增敏比(SER)为0．86(Do值比)、0．98(SF_2值比),照射后给药SER为0．99(Do值比)、1．09 (SF_2值比)。IC_(50)剂量的As_2O_3,照射前给药SER为0．90(Do值比)、0．87(SF_2值比),照射后给药SER为1．14(Do值比)、1．08(SF_2值比)。IC_(90)剂量的As_2O_3照射前给药和照射后给药的SER均为1．14(Do值比)、3．20(SF_2值比),As_2O_3对低剂量照射的放射增敏作用好于高剂量照射(SER_(SF_2)＞SER_(Do))。结论As_2O_3对HT1080纤维肉瘤细胞具有一定的放射增敏作用,为临床放疗和As_2O_3联合应用提供了实验依据。