苦参碱对缺氧/复氧小鼠海马神经元HT22细胞活力、凋亡的影响及机制研究

目的探讨苦参碱对缺氧/复氧(H/R)小鼠海马神经元HT22细胞活力、凋亡及脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶受体B(TrkB)信号通路的影响。方法将处于对数生长期的HT22细胞分为对照组、H/R组及苦参碱低、中、高浓度组。对照组HT22细胞用无血清DMEM培养基在正常环境下培养28 h;H/R组HT22细胞在缺氧培养箱中维持4 h后在常氧条件下培养24 h;苦参碱低、中、高浓度组的H/R处理同H/R组,同时给予浓度分别为10、20、30μmol/L的苦参碱进行干预,培养24 h。检测HT22细胞活力、凋亡情况及凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)]和BDNF/TrkB信号通路蛋白水平。结果与对照组比较,H/R组HT22细胞吸光度值、存活率、Bcl-2、BDNF、TrkB蛋白水平降低,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与H/R组比较,苦参碱低、中、高浓度组HT22细胞吸光度值、存活率、Bcl-2、BDNF、TrkB蛋白水平依次升高,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白水平依次降低,差异有统计学意义(P<0.05),呈浓度依赖性。结论苦参碱能减轻H/R导致的神经元HT22细胞活力的降低,抑制HT22细胞凋亡,其机制可能与激活BDNF/TrkB信号通路有关。

姜酮通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻OGD/R后氧化应激损伤对HT22细胞凋亡的抑制作用

目的:探讨姜酮对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)后小鼠海马神经元HT22细胞的保护作用,阐明其相关作用机制。方法:培养HT22细胞,设置不同OGD/R时间梯度,建立OGD/R细胞损伤模型。HT22细胞分为对照组、OGD/R组、OGD/R+1μmol·L^(-1)姜酮组、OGD/R+10μmol·L^(-1)姜酮、OGD/R+100μmol·L^(-1)姜酮组和OGD/R+0.2%二甲亚枫(DMSO)组,CCK-8法检测各组细胞活性并计算各组细胞存活率,确定姜酮最适药物浓度。细胞分为对照组、OGD/R组、OGD/R+姜酮组和OGD/R+姜酮+核因子E2相关因子2(Nrf2)抑制剂(ML385)组,OGD/R+姜酮组细胞经姜酮给药处理4 h后予以OGD 8 h和复糖复氧8 h处理,OGD/R+姜酮+ML385组细胞在姜酮给药前予以10μmol·L^(-1)ML385预处理6 h,CCK-8法检测各组细胞活性,Western blotting法检测各组细胞中Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组细胞培养上清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平。结果:与对照组比较,HT22细胞经OGD 8 h和复糖复糖8 h处理后细胞存活率低于50%,以OGD 8 h和复糖复糖8 h建立HT22细胞OGD/R模型。与OGD/R组比较,OGD/R+不同剂量姜酮组细胞存活率均不同程度升高,其中OGD/R+100μmol·L^(-1)姜酮组细胞存活率升高最明显(P<0.01),故选用100μmol·L^(-1)姜酮用于后续实验。与对照组比较,OGD/R组细胞活性明显降低(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05),细胞培养上清中SOD活性明显降低(P<0.01),MDA水平明显升高(P<0.01);与OGD/R组比较,OGD/R+姜酮组细胞活性明显升高(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01),Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.05),细胞培养上清中SOD活性明显升高(P<0.01),MDA水平明显降低(P<0.01);与OGD/R+姜酮组比较,OGD/R+姜酮+ML385组细胞活性明显降低(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.01),细胞培养上清中SOD活性明显降低(P<0.01),MDA水平明显升高(P<0.05)。结论:姜酮可通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻OGD/R后氧化应激损伤对HT22细胞凋亡的抑制作用。

小檗碱对冈田酸诱导HT22细胞损伤的保护作用

目的 本实验以冈田酸（OA）损伤的HT22细胞作为氧化应激损伤的体外模型,探讨小檗碱对OA氧化应激损伤作用的影响及其机制。方法 应用CCK-8法检测不同浓度冈田酸（0、20、40、60、80、160 nmol/L）损伤HT22细胞12 h后的细胞活力;不同浓度小檗碱（2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L）预处理HT22细胞12 h后加入OA损伤12 h,应用CCK-8比色法检测细胞的增殖状况;倒置显微镜下观察细胞形态学变化;应用试剂盒对细胞丙二醛（MDA）和抗氧化酶（SOD-1和GSH-Px）活性的进行测定;2′,7′-dichlorfluorescein-diacetate（DCFH-DA）染色检测HT22细胞内ROS水平;Western blot法检测Cleaved caspase-3蛋白的表达。结果 OA（0-160 nmol/L）处理HT22细胞12 h后,细胞活力分别为（100.00±0.42）%、（91.96±1.18）%、（72.79±1.51）%、（57.89±3.18）%、（41.50±1.58）%、（33.83±1.59）%,细胞活力呈浓度依赖性下降;小檗碱（2.5-20.0μmol/L）预处理细胞12 h后,再给予OA作用12 h,细胞活力由OA单独损伤组（76.48±3.94）%,分别上升至（89.18±3.38）%、（97.06±5.56）%、（94.85±3.16）%、（87.52±4.81）%;小檗碱（5.0、10.0μmol/L）预处理组,减少了MDA的产生,抑制了细胞内ROS的积聚,提高了抗氧化酶（SOD-1和GSH-Px）活性,下调了Cleaved caspase-3蛋白表达。结论 小檗碱可以通过对抗OA诱导的HT22细胞氧化应激损伤和凋亡发挥其神经保护作用。

HT22细胞氧糖剥夺再灌注及Grasp65过表达干预后高尔基体的形态变化及其可能机制研究

目的探讨HT22细胞氧糖剥夺再灌注及Grasp65过表达干预后高尔基体的形态变化及其可能机制。方法利用小鼠海马神经元细胞系HT22为研究对象,HT22细胞经氧糖剥夺再灌注损伤及Grasp65过表达干预后,采用MTT法检测细胞存活率;Hoechest33258荧光染色法评估细胞凋亡;并应用细胞免疫荧光技术观察高尔基体的形态;应用Western blot技术检测GM130和GAAP蛋白的表达。结果氧糖剥夺再灌注可导致HT22细胞的活性显著降低(P<0.05),凋亡率显著增高(P<0.05);并可导致高尔基体形态的异常,随着再灌注时间的延长,高尔基体逐渐发生碎裂,尤其以再灌注12 h和24 h最为明显;GM130、GAAP的表达水平在氧糖剥夺再灌注后出现下降,特别是在再灌注12 h、24 h后出现了显著下降(P<0.05)。过表达Grasp65后,HT22细胞在氧糖剥夺再灌注所致高尔基体碎裂出现减少(P<0.05),碎裂程度减轻,同时GM130和GAAP的表达均显著增加(P<0.05),HT22细胞的存活率大大提高(P<0.05),凋亡率显著降低(P<0.05)。结论缺血再灌注损伤的细胞模型中,同样发生了高尔基体的碎裂;过表达Grasp65可以减轻氧糖剥夺再灌注损伤所致的高尔基体碎裂,并可以减少HT22细胞的凋亡,其机制可能与上调GM130和GAAP的表达有关。

蛋白酶抑制剂H89对神经元细胞氧糖剥夺再灌注后高尔基体形态及细胞凋亡的影响

目的探讨蛋白酶抑制剂H89对神经元细胞经氧糖剥夺再灌注损伤后高尔基体形态和细胞凋亡的影响。方法将体外常规培养的小鼠海马神经元细胞HT22分为对照组、模型组和H89干预组。模型组与H89干预组按再灌注时间点分6h、12h和24h三个亚组。采用MTT法检测细胞存活率;Hoechest33258荧光染色法评估细胞凋亡;细胞免疫荧光技术观察高尔基体形态;Western blot技术检测GM130与GAAP蛋白表达。结果 H89干预组较模型组细胞活力有所上升,其中12h时间点(OD值0.1467±0.0090)与同期模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。H89干预组较模型组细胞凋亡率有所下降,但差异均无统计学意义(P>0.05)。H89干预组在6h和12h时间点高尔基体碎裂程度较同期模型组稍有减轻。H89干预组GM130表达水平较模型组无显著升高(P>0.05)。GAAP表达水平仅在24h时间点(灰度比值0.4066±0.0288)显著升高(P<0.05)。结论 H89干预不能减轻神经元细胞经氧糖剥夺再灌注损伤后的高尔基体碎裂和细胞凋亡。

越鞠丸合甘麦大枣汤加减对谷氨酸诱导的HT22细胞损伤模型的神经保护作用

目的:探讨越鞠丸合甘麦大枣汤加减(YJGZ)对谷氨酸诱导的小鼠海马神经元细胞系(HT22)细胞损伤的神经保护作用。方法:HT22细胞系无菌培养,以高浓度谷氨酸建立细胞损伤模型,并制备YJGZ水提液和含药血清,分为正常组,模型组,YJGZ含药血清组(1%,5%,10%),YJGZ水提液组(166 mg·L^(-1)),尼莫地平组(100μmol·L^(-1))。噻唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞存活率;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率及细胞内活性氧自由基(ROS)的含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马N-甲基-D-天冬氨酸受体亚单位2B蛋白(NR2B),环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB),磷酸化CREB(p-CREB),细胞外调节蛋白激酶(ERK),磷酸化ERK(p-ERK)的蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组细胞存活率显著下降(P <0. 01),乳酸脱氢酶(LDH)释放率明显增加(P <0. 05),细胞内活性氧(ROS)水平明显增加(P <0. 05),NR2B蛋白的表达明显升高(P <0. 05),CREB,p-CREB,ERK,p-ERK蛋白表达水平明显降低(P <0. 05);与模型组比较,YJGZ水提液组和尼莫地平组均能显著提高谷氨酸模型条件下HT22细胞的存活率(P <0. 01),减少细胞损伤,减少LDH的释放率,降低细胞内ROS水平(P <0. 05,P <0. 01),降低NR2B蛋白的表达水平(P <0. 05),增加CREB,p-CREB,ERK,p-ERK蛋白的表达(P <0. 05); YJGZ含药血清组与模型组比较,HT22细胞存活率并没有提高。结论:YJGZ水提液对谷氨酸诱导的HT22细胞损伤具有显著的保护作用。

紫檀芪对神经元细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制研究

目的 研究紫檀芪（PTE）对HT22神经元细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制.方法 将体外常规培养的小鼠海马HT22神经元细胞分为缺氧复氧损伤模型组、1.25 μmol/L、2.5μmol/L、5 μmol/L PTE组,后3组细胞加入不同浓度的PTE培养2h后,4组细胞均建立细胞缺氧复氧损伤模型,继续培养6h后采用MTT检测4组细胞存活率,乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒检测细胞LDH释放量,2＇,7＇-二氢二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测细胞内氧化应激产物活性氧（ROS）的水平,TUNEL试剂盒检测细胞凋亡率,Western blotting检测细胞Bax、Bcl-2蛋白的表达.结果 缺氧复氧损伤模型组、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5μmol/L PTE组细胞存活率依次增高（48.34％±4.28％、55.45％±3.62％、67.23％±4.37％、81.87％±5.02％）,细胞LDH释放量（45.17％±3.06％、38.04％±3.07％、31.42％±2.94％、24.24％±3.52％）、ROS水平、凋亡率依次降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）.Western blotting检测显示缺氧复氧损伤模型组、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5μmol/L PTE组细胞Bcl-2蛋白的表达逐渐增高,Bax蛋白的表达逐渐降低,统计显示4组细胞Bax/Bcl-2比值依次降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 PTE对神经元细胞缺氧复氧损伤有明确的保护作用,其机制与降低细胞氧化应激损伤和减少细胞凋亡有关.

重组人Neuritin蛋白生物学活性的定量分析方法

目的建立一种快速高效地定量评价重组人Neuritin(rhNeuritin)蛋白生物学活性的新方法。方法首先建立小鼠海马神经元细胞(HT22细胞)维持培养条件。在此条件下,明确rhNeuritin蛋白作用于HT22细胞的最佳检测时间。根据11组不同浓度梯度的rhNeuritin蛋白对HT22细胞存活的影响,建立标准品rhNeuritin蛋白与HT22细胞存活的量效关系曲线;并确定rhNeuritin蛋白的检测范围。在rhNeuritin蛋白的检测限内,根据标准品rhNeuritin蛋白与HT22细胞存活之间的量效关系的拟合曲线,制订标准品蛋白的活性单位,建立了针对rhNeuritin蛋白生物学活性的评价体系。利用两批测试品rhNeuritin蛋白,对该方法的重复性和准确性进行了验证。结果HT22细胞的维持培养液的浓度为0.4%FBS,rhNeuritin蛋白作用于HT22细胞的最佳检测时间为72 h,rhNeuritin蛋白浓度在62.5~1000 ng·mL^(-1)的检测限内,HT22细胞的存活与rhNeuritin蛋白的浓度呈正相关。在rhNeuritin蛋白的检测线内,拟定标准品的EC50为一个活性单位。两组测试品rhNeuritin蛋白的量效关系曲线与标准品呈现相同趋势,3者R 2均大于0.9,说明该方法的重复性很好。通过拟订的标准品的活性单位,计算得到500 ng·mL^(-1)时测试品1和测试品2的活性单位分别为1.059、1.069,而实验实际测得测试品1和测试品2的活性单位分别为1.074和1.088,与测定的活性单位相比,两组测试品计算得到的活性单位的误差小于2%,说明该实验方法具有较好的准确性。结论成功建立了重组人Neuritin蛋白的定量检测方法,并制定了明确的活性单位。