苦参碱对缺氧/复氧小鼠海马神经元HT22细胞活力、凋亡的影响及机制研究

目的探讨苦参碱对缺氧/复氧(H/R)小鼠海马神经元HT22细胞活力、凋亡及脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶受体B(TrkB)信号通路的影响。方法将处于对数生长期的HT22细胞分为对照组、H/R组及苦参碱低、中、高浓度组。对照组HT22细胞用无血清DMEM培养基在正常环境下培养28 h;H/R组HT22细胞在缺氧培养箱中维持4 h后在常氧条件下培养24 h;苦参碱低、中、高浓度组的H/R处理同H/R组,同时给予浓度分别为10、20、30μmol/L的苦参碱进行干预,培养24 h。检测HT22细胞活力、凋亡情况及凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)]和BDNF/TrkB信号通路蛋白水平。结果与对照组比较,H/R组HT22细胞吸光度值、存活率、Bcl-2、BDNF、TrkB蛋白水平降低,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与H/R组比较,苦参碱低、中、高浓度组HT22细胞吸光度值、存活率、Bcl-2、BDNF、TrkB蛋白水平依次升高,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白水平依次降低,差异有统计学意义(P<0.05),呈浓度依赖性。结论苦参碱能减轻H/R导致的神经元HT22细胞活力的降低,抑制HT22细胞凋亡,其机制可能与激活BDNF/TrkB信号通路有关。

越鞠丸合甘麦大枣汤加减对谷氨酸诱导的HT22细胞损伤模型的神经保护作用

目的:探讨越鞠丸合甘麦大枣汤加减(YJGZ)对谷氨酸诱导的小鼠海马神经元细胞系(HT22)细胞损伤的神经保护作用。方法:HT22细胞系无菌培养,以高浓度谷氨酸建立细胞损伤模型,并制备YJGZ水提液和含药血清,分为正常组,模型组,YJGZ含药血清组(1%,5%,10%),YJGZ水提液组(166 mg·L^(-1)),尼莫地平组(100μmol·L^(-1))。噻唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞存活率;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率及细胞内活性氧自由基(ROS)的含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马N-甲基-D-天冬氨酸受体亚单位2B蛋白(NR2B),环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB),磷酸化CREB(p-CREB),细胞外调节蛋白激酶(ERK),磷酸化ERK(p-ERK)的蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组细胞存活率显著下降(P <0. 01),乳酸脱氢酶(LDH)释放率明显增加(P <0. 05),细胞内活性氧(ROS)水平明显增加(P <0. 05),NR2B蛋白的表达明显升高(P <0. 05),CREB,p-CREB,ERK,p-ERK蛋白表达水平明显降低(P <0. 05);与模型组比较,YJGZ水提液组和尼莫地平组均能显著提高谷氨酸模型条件下HT22细胞的存活率(P <0. 01),减少细胞损伤,减少LDH的释放率,降低细胞内ROS水平(P <0. 05,P <0. 01),降低NR2B蛋白的表达水平(P <0. 05),增加CREB,p-CREB,ERK,p-ERK蛋白的表达(P <0. 05); YJGZ含药血清组与模型组比较,HT22细胞存活率并没有提高。结论:YJGZ水提液对谷氨酸诱导的HT22细胞损伤具有显著的保护作用。

紫檀芪对神经元细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制研究

目的 研究紫檀芪（PTE）对HT22神经元细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制.方法 将体外常规培养的小鼠海马HT22神经元细胞分为缺氧复氧损伤模型组、1.25 μmol/L、2.5μmol/L、5 μmol/L PTE组,后3组细胞加入不同浓度的PTE培养2h后,4组细胞均建立细胞缺氧复氧损伤模型,继续培养6h后采用MTT检测4组细胞存活率,乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒检测细胞LDH释放量,2＇,7＇-二氢二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测细胞内氧化应激产物活性氧（ROS）的水平,TUNEL试剂盒检测细胞凋亡率,Western blotting检测细胞Bax、Bcl-2蛋白的表达.结果 缺氧复氧损伤模型组、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5μmol/L PTE组细胞存活率依次增高（48.34％±4.28％、55.45％±3.62％、67.23％±4.37％、81.87％±5.02％）,细胞LDH释放量（45.17％±3.06％、38.04％±3.07％、31.42％±2.94％、24.24％±3.52％）、ROS水平、凋亡率依次降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）.Western blotting检测显示缺氧复氧损伤模型组、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5μmol/L PTE组细胞Bcl-2蛋白的表达逐渐增高,Bax蛋白的表达逐渐降低,统计显示4组细胞Bax/Bcl-2比值依次降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 PTE对神经元细胞缺氧复氧损伤有明确的保护作用,其机制与降低细胞氧化应激损伤和减少细胞凋亡有关.

重组人Neuritin蛋白生物学活性的定量分析方法

目的建立一种快速高效地定量评价重组人Neuritin(rhNeuritin)蛋白生物学活性的新方法。方法首先建立小鼠海马神经元细胞(HT22细胞)维持培养条件。在此条件下,明确rhNeuritin蛋白作用于HT22细胞的最佳检测时间。根据11组不同浓度梯度的rhNeuritin蛋白对HT22细胞存活的影响,建立标准品rhNeuritin蛋白与HT22细胞存活的量效关系曲线;并确定rhNeuritin蛋白的检测范围。在rhNeuritin蛋白的检测限内,根据标准品rhNeuritin蛋白与HT22细胞存活之间的量效关系的拟合曲线,制订标准品蛋白的活性单位,建立了针对rhNeuritin蛋白生物学活性的评价体系。利用两批测试品rhNeuritin蛋白,对该方法的重复性和准确性进行了验证。结果HT22细胞的维持培养液的浓度为0.4%FBS,rhNeuritin蛋白作用于HT22细胞的最佳检测时间为72 h,rhNeuritin蛋白浓度在62.5~1000 ng·mL^(-1)的检测限内,HT22细胞的存活与rhNeuritin蛋白的浓度呈正相关。在rhNeuritin蛋白的检测线内,拟定标准品的EC50为一个活性单位。两组测试品rhNeuritin蛋白的量效关系曲线与标准品呈现相同趋势,3者R 2均大于0.9,说明该方法的重复性很好。通过拟订的标准品的活性单位,计算得到500 ng·mL^(-1)时测试品1和测试品2的活性单位分别为1.059、1.069,而实验实际测得测试品1和测试品2的活性单位分别为1.074和1.088,与测定的活性单位相比,两组测试品计算得到的活性单位的误差小于2%,说明该实验方法具有较好的准确性。结论成功建立了重组人Neuritin蛋白的定量检测方法,并制定了明确的活性单位。