腺相关病毒携带hTERT启动子调控的TRAIL基因特异性杀伤肿瘤细胞

背景与目的:腺相关病毒(adeno-associated virus)作为载体已被广泛用于肿瘤的基因治疗研究。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand,TRAIL)基因可迅速诱导多种肿瘤细胞的凋亡,是一个安全有效的肿瘤杀伤基因。本研究旨在构建能在肿瘤细胞内特异性表达TRAIL基因的靶向腺相关病毒,并探讨其体外抗肿瘤效应的可能机制。方法:利用肿瘤特异性启动子端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)构建特异性杀伤肿瘤细胞的腺相关病毒载体pAAV-hTERT-TRAIL。通过与pAAV-RC、pHelper共转染HEK293细胞包装出病毒AAV-hTERT-TRAIL。将该病毒体外转染人结肠癌SW620细胞、人肝癌HepG2细胞、人肺癌A549细胞和正常细胞NHLF、MRC5后,检测TRAIL基因的肿瘤特异性表达。MTT法检测其对细胞增殖的影响,ELISA、Westernblot法以及流式细胞仪检测细胞的凋亡,并分析其体外抗肿瘤效应的可能机制。结果:成功包装出病毒AAV-hTERT-TRAIL。RT-PCR、Western blot和免疫组化法均证实AAV-hTERT-TRAIL能介导TRAIL基因在肿瘤细胞内特异性表达,但在正常细胞内不表达。以100 MOI AAV-hTERT-TRAIL感染细胞96h后,SW620、A549和HepG2细胞的增殖率分别是41.55%、44.29%、49.95%,NHLF和MRC5细胞的增殖率分别是84.59%和87.22%。Westernblot检测发现AAV-hTERT-TRAIL可激活Caspase通路,流式细胞仪和ELISA方法检测证实AAV-hTERT-TRAIL可诱导细胞凋亡。结论:hTERT的存在增强了腺相关病毒所携带TRAIL基因表达的肿瘤靶向性和对正常细胞的安全性,由它调控的杀伤基因可介导肿瘤细胞特异性的细胞毒效应。

hTERT启动子调控的TRAIL基因表达载体的构建及其对肝癌细胞增殖的抑制作用

目的:构建hTERT启动子调控的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)基因表达载体,探讨其对肝癌细胞SMMC7721和肝细胞HL7702增殖的抑制作用。方法:采用分子生物学方法构建重组质粒pshuttle-TRAIL和pshuttle-hTERT-TRAIL,经PCR和酶切鉴定正确后,通过脂质体转染SMMC7721和HL7702细胞,同时转染pcDNA3.1+-GFP并用荧光显微镜检测转染效率。MTT法检测重组质粒对细胞增殖变化的影响。结果:成功构建重组质粒pshuttle-TRAIL和pshuttle-hTERT-TRAIL,荧光显微镜检测结果显示:质粒与脂质体的比例为1∶3时细胞转染效率最高。pshuttle-hTERT-TRAIL组SMMC7721细胞增殖抑制率从16h开始明显增加,与对照组比较差异有显著性(P<0.001),且从24h开始与pshuttle-TRAIL组比较细胞增殖抑制率明显增加(P<0.05);但重组质粒对HL7702细胞增殖抑制率无影响。结论:hTERT启动子调控的TRAIL可明显抑制肝癌细胞的增殖,而对人肝细胞的增殖无影响,其作用效果明显优于TRAIL单基因治疗。

hTERT启动子调控的HSV-tk基因逆转录病毒载体的构建及SKOV3转染细胞的生物学特性观察

目的 :观察转染有人端粒酶逆转录酶基因 (humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)启动子调控的单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (herpessimplexvirusthymidinekinase ,HSV tk)基因的人卵巢癌细胞的部分生物学特性。方法 :构建hTERT启动子调控的HSV tk基因重组逆转录病毒载体 ,筛选携带该载体的包装细胞 ,测定包装细胞产生的逆转录病毒滴度 ,并用病毒颗粒感染人卵巢癌SKOV3细胞 (SKOV3/tk细胞 )并经RT PCR方法鉴定。然后倒置显微镜下观察SKOV3/tk细胞形态 ,MTT法研究细胞生长特性 ,并观察转染细胞裸鼠体内的成瘤能力。结果 :包装细胞产生的病毒滴度可达 2× 1 0 3 cfu·ml-1 。SKOV3/tk细胞扩增出 770bp的tk基因片段 ,形态与SKOV3细胞无明显差异 ;倍增时间 72h ,无明显变化 ;裸鼠体内的成瘤能力较SKOV3细胞下降。结论 :hTERT调控的HSV tk基因逆转录病毒载体构建成功 ;

hTERT启动子驱动的肿瘤抑素靶向肝癌细胞表达及其抗血管形成的作用

目的:观察人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子驱动的肿瘤抑素(tamsta-tin)基因在肝癌细胞HepG2内特异性表达及其体外抗血管形成的作用。方法:构建phTERT-tumstatin、pCMV-tumstatin(阳性对照)、phTERT-EGFP(阴性对照)质粒,脂质体介导转染HepG2肝癌细胞、L-02正常肝细胞,荧光显微镜检测EGFP的表达。Western blotting检测tumstatin在HepG2细胞内的表达,MTS法检测稳定转染后HepG2细胞的增殖以及含或不含tumstatin蛋白的条件培养基对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cell,HUVEC)增殖的影响。通过计数管样分支数检测tumstatin蛋白对HUVEC管道结构形成的影响。结果:成功构建phTERT-tumstatin、pCMV-tumstatin和phTERT-EGFP质粒,质粒转染后tumstatin基因在肝癌细胞HepG2中特异地表达,在正常肝细胞L-02中无表达。phTERT-tumstatin和phTERT-EG-FP转染均不影响HepG2细胞的增殖。含tumstatin蛋白的条件培养基CM-T抑制HUVEC的增殖[抑制率为(56.49±0.33)%];CM-T与不含tumstatin蛋白的条件培养基CM-N、CM-NT相比显著抑制了HUVEC血管结构的形成[(3.33±1.53)%vs(24.44±3.11)%、(23.94±2.92)%,P<0.01)]。结论:phTERT基因启动子可驱动tumstatin靶向表达于肝癌细胞,并抑制HUVEC血管管道结构形成。

hTERT启动子调控rVBMDMP基因表达载体的构建与功能研究

为了探讨端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子调控重组血管基膜衍生多功能肽(rVBMDMP)基因表达抑制肺癌细胞生长的作用机制,采用PCR方法,克隆hTERT启动子核心区片段,并检测其功能活性.然后,构建pLNSX/hTERT/rVBMDMP逆病毒载体,获取逆病毒,感染肺癌A549细胞,检测hTERT启动子调控rVBMDMP基因表达对细胞形态、细胞生长、细胞凋亡以及Caspase-3表达的影响.另外,观察hTERT启动子调控rVBMDMP基因表达对裸鼠成瘤的抑制作用、瘤组织细胞的凋亡及Caspase-3表达情况.结果发现:a.hTERT启动子核心区能调控rVBMDMP基因的表达(n=3,P<0.05);b.hTERT启动子调控rVBMDMP基因的表达具有抑制肺癌A549细胞的生长和裸鼠成瘤作用(n=6,P<0.05);c.rVBMDMP基因表达能促进肺癌A549细胞凋亡和Caspase-3蛋白表达.以上结果说明,hTERT启动子调控rVBMDMP基因表达后,通过提高Caspase-3的表达水平,促进细胞凋亡而抑制肺癌A549细胞的生长.

HRE增强hTERT启动子-tk/GCV基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的杀伤作用

目的:探讨缺氧反应元件(HRE)增强hTERT启动子-tk/GCV逆转录病毒基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的体外杀伤作用。方法:构建由HRE缺氧反应元件修饰的hTERT杂合启动子和hTERT单一启动子引导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因表达的重组逆转录病毒载体,在脂质体介导下分别转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。将重组病毒感染人肺癌细胞SPC-A1和人肝癌细胞Bel-7402,G418筛选出抗性克隆肿瘤细胞。实验分为对照组、SPC-A1/tk组和Bel-7402/tk组。在缺氧处理条件下,MTT法检测前体药物丙氧鸟苷(GCV)对SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞的杀伤效应,流式细胞仪检测其细胞凋亡率和细胞周期的变化。结果:与对照组比较,缺氧环境培养的SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞对GCV的敏感性明显增强,其中细胞凋亡率明显升高(P<0.001),细胞周期各期细胞数有所减少(P<0.05)。与hTERT启动子引导的tk基因系统组细胞比较,[HRE]hTERT杂合启动子引导的tk基因系统组肿瘤细胞存活率更低(P<0.01),诱导肿瘤细胞凋亡率明显升高(P<0.01),G1期和G0期细胞数有所增高(P<0.05),S期细胞数减少(P<0.05)。结论:HRE能增强hTERT启动子-tk/GCV自杀基因系统对缺氧环境中肿瘤细胞的体外杀伤作用。

hTERT启动子调控下PE38KDEL表达载体的构建及其在MiaPaCa_2人胰腺癌细胞中的表达

目的探讨端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)表达载体的构建及其在MiaPaCa2人胰腺癌细胞中的表达。方法通过PCR法扩增hTERT启动子,全基因合成PE38KDEL,将其分别亚克隆到pIRES2-EGFP及phTERTp-IRES2-EGFP质粒的多克隆位点中;均经酶切及测序鉴定。通过脂质体法将两质粒分别转染MiaPaCa2及WI-38细胞,观察荧光表达情况,通过RT-PCR检测PE38KDEL的表达。结果经酶切及测序鉴定证实质粒构建成功,pPE38KDEL-IRES2-EGFP转染后MiaPaCa2和WI-38细胞中均有PE38KDEL基因表达;但phTERTp-PE38KDEL-IRES2-EGFP转染后仅MiaPaCa2中有PE38KDEL基因表达。结论 hTERT调控下PE38KDEL表达载体构建成功,并可在MiaPaCa人胰腺癌细胞中靶向性表达,为探讨胰腺癌的靶向基因治疗提供了实验依据。

hTERT启动子引导的NIS基因重组腺病毒的构建

目的:构建在人端粒酶逆转录酶(hTERT)核心启动子引导钠碘转运体(NIS)基因的重组腺病毒。方法:PCR扩增目的片断;通过荧光分析实验,选取启动效果最好的hTERT启动子片断;建立3个重组腺病毒:Ad-hTERT-NIS、Ad-CMV-NIS及Ad-CMV-TPO,培养胶质瘤细胞系U87、U251及细胞系MRC-5(正常人胚胎成纤维细胞系),然后转染病毒并进行western bolt分析等实验。结果:胶质瘤细胞U87及U251中端粒酶为阳性,hTERT启动子片段204启动效率比较其他片段效率高,该启动子片段可以引导NIS基因的靶向性表达。结论:成功构建在hTERT核心启动子引导NIS基因的Ad-hTERT-NIS及重组腺病毒Ad-CMV-NIS和Ad-CMV-TPO,该重组腺病毒转染胶质细胞U87和U251后能成功表达NIS及TPO基因。

hTERT启动子的转录调控机制及其靶向性介导肿瘤治疗的研究进展

端粒酶与肿瘤发生发展的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物,在绝大多数恶性肿瘤细胞中呈阳性表达,而在正常体细胞中则一般为阴性。端粒酶的活性表达主要是通过hTERT基因的转录机制严格调控的。端粒酶的活化与肿瘤的发生发展及细胞衰老和永生化关系密切。hTERT基因启动子为恶性肿瘤早期诊断、预后评估及基因治疗提供了新的思路。

hTERT启动子介导自杀基因在肿瘤细胞中的靶向表达

肿瘤的基因治疗中，如何保证自杀基因只在特异性组织或细胞中表达而不在人正常组织细胞中表达是一个亟待解决的问题。与特异性组织来源的启动子如CEA启动子、AFP启动子、Tyr启动子等启动子相比，运用hTERT启动子能够驱动自杀基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中靶向表达，更具广谱性，因此在肿瘤治疗中成为一个有广阔前景的新方法。

使用hTERT启动子联合RNAi靶向逆转乳腺癌的耐药性

目的:克隆人端粒酶逆转录酶启动子(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT),探讨对乳腺癌细胞的特异性[1],利用RNAi技术靶向沉默耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein,BCRP)基因[2]的表达,观察BCRP的mRNA变化,BCRP蛋白的表达以及对阿霉素耐药性的变化[3]。方法:构建重组质粒(pGenesil-CMV-shRNA、pGenesil-hTERT-shRNA),分别转染端粒酶阴性及阳性细胞,检测hTERT启动子的靶向性,应用RT-PCR及Western-blot技术检测不同组的细胞的RNA、蛋白差异,MTT法分析药敏性变化[4]。结果:端粒酶阳性的细胞可见很强的荧光,明显强于端粒酶阴性的细胞[5];细胞实验RT-PCR及Western blot检测结果显示:BCRP的mRNA和蛋白的表达受抑制与对照组其差异有显著性(P<0.05);MTT比色法结果显示:对阿霉素的药物敏感性明显提高。结论:使用hTERT启动子联合RNAi成功靶向沉默BCRP基因,乳腺癌MCF-7/ADR对阿霉素的敏感性明显增加,为进一步开发肿瘤的特异性基因沉默治疗奠定实验基础。

喉癌细胞hTERT启动子介导基因治疗研究

目的研究喉癌细胞中端粒酶活性、端粒酶逆转录酶（hTERT）表达和hTERT启动子活性的关系，以及hTERT启动子介导喉癌基因治疗的可行性。方法将含hTERT启动子的质粒转染不同放射敏感性喉癌细胞（Hep2和Hep2R），通过报告基因评价启动子活性，RT-PCR检测hTERT mRNA表达，PCR—ELISA法检测端粒酶活性。构建质粒phTERTp-HRP，用RT-PCR和酶活性分析评价辣根过氧化物酶（HRP）表达，以克隆形成实验评价phTERTp-HRP／吲哚乙酸（IAA）对克隆形成率和放射敏感性的影响。结果Hep2R的端粒酶活性、hTERT mRNA表达水平和hTERT启动子活性分别是Hep2的1．37、1．43和1．81倍。hTERT启动子活性与hTERT mRNA表达水平和端粒酶活性之间显著正相关（P〈0．01）。转染phTERTp-HRP后，Hep2R细胞中HRP mRNA表达和HRP活性水平分别是Hep2细胞的2．1倍和1．8倍。0．5mmol／L IAA处理后，SERSF2分别为1．24（Hep2R）和1．20（Hep2），无IAA和有IAA组存活曲线参数α分别为0．020、0．090（Hep2R）和0．042、0．099（Hep2）。结论hTERT启动子可用于不同放射敏感性喉癌细胞的基因治疗。hTERTp—HRP／IAA基因治疗有望用于喉癌细胞的靶向杀伤和放射增敏。

hTERT启动子调控的腺病毒载体的构建及在前列腺癌细胞中的表达

目的 构建人端粒酶逆转录酶 (hTERT )启动子调控的表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒系统 ,并研究其在前列腺癌细胞株PC 3中的表达。方法 构建带有hTERT启动子的腺病毒穿梭载体pDC3 15 Tp EGFP ,细胞重组技术获得腺病毒AdhTERT EGFP ,体外转染PC 3及人胚肺成纤维细胞株MRC 5 ,通过RT PCR和倒置荧光显微镜分别在mRNA和蛋白质水平检测EGFP的表达。带有小鼠巨细胞病毒 (mCMV)启动子的腺病毒Ad EGFP作为阳性对照。结果 成功构建出腺病毒AdhTERT EGFP ,滴度为 4.2× 10 9空斑形成单位 (pfu) /ml,分别转染PC 3和MRC 5 ,前者表达EGFP的阳性细胞数为 (66.4% 3 .3 ) % ,而后者不表达EGFP(P <0 .0 1) ;对照病毒Ad EGFP在PC 3和MRC 5中分别有 (88.1± 2 .2 ) %及 (89.2± 3 .1) %的细胞表达EGFP ,两者表达量差异无统计学意义。结论 该腺病毒系统中hTERT启动子调控下游基因可选择性地在前列腺肿瘤细胞中表达 ,在正常细胞中不表达 ,具有明显的靶向性。

hTERT启动子调控腺病毒介导的HSV—tk／GCV基因系统治疗人膀胱癌

我们在体外实验已证实，hTERT启动子调控腺病毒介导的HSV-tk／GCV基因对膀胱癌细胞有选择性的杀伤作用，而对正常细胞不产生明显影响。我们采用BALB／C裸鼠建立荷人膀胱癌动物模型，给予重组腺病毒静脉内注射治疗，观察其在体内的治疗效果及安全性。

肿瘤细胞特异启动子hTERT介导的靶向mdr1基因的RNAi用于逆转卵巢癌细胞MDR的研究

目的:探索应用肿瘤细胞特异启动子hTERT介导靶向肿瘤多药耐药基因mdr1的siRNA在卵巢肿瘤细胞特异表达并逆转MDR的可行性。方法:应用携带luc报告基因的报告质粒验证了hTERT启动子在卵巢肿瘤细胞株A2780中的转录活性,构建由hTERT启动子引导的靶向mdr1基因的siRNA表达载体phTERTsiMDR1B,并与携带mdr1基因靶序列的报告质粒进行共转染抑制实验,进一步将phTERT-siMDR1B表达载体与mdr1基因表达载体共转染A2780细胞,检测细胞中mdr1基因的mRNA与P-gp蛋白的表达水平。以具有耐紫杉醇表型的A2780细胞作为靶细胞进行耐药评价实验。结果:hTERT启动子在卵巢肿瘤细胞株A2780中具有良好的转录活性,而在正常人二倍体细胞株MRC-5中无转录活性;hTERT启动子介导的siMDR1B具有良好的抑制效果与特异性;hTERT启动子介导的siMDR1B可显著抑制细胞中mdr1基因的mRNA与P-gp蛋白的表达水平;转染了hTERT启动子介导的siMDR1B表达元件的细胞对紫杉醇的耐药程度显著降低。结论:hTERT启动子介导的靶向mdr1基因的RNAi用于逆转卵巢癌细胞MDR是可行的,本研究结果可为进一步开展卵巢肿瘤MDR逆转研究提供重要基础。

hTERT启动子调控PE38KDEL基因载体的构建及其鉴定

目的构建含有hTERT启动子和PE38KDEL基因片段的质粒phTERTp-PE38KDEL-IRES2-EGFP并对其鉴定。方法通过PCR方法扩增hTERTp,用其取代pIRES2-EGFP质粒的CMV启动子,全基因合成PE38KDEL基因片段,将其亚克隆到hTERTp-IRES2-EGFP的MCS中,经酶切及测序鉴定。结果经鉴定,成功将hTERTp及PE38KDEL两个基因片段插入亚克隆到pIRES2-EGFP中。结论成功构建phTERTp-PE38KDEL-IRES2-EGFP真核表达载体,有望使PE38KDEL阳性的胰腺癌细胞中特异性表达,起到杀伤胰腺癌细胞的作用,为肿瘤的靶向基因治疗提供了一条新思路。

hAFP及hTERT双启动子调控的针对人IGF-II基因的siRNA特异性抑制人肝癌细胞生长

目的:设计并筛选高效沉默胰岛素样生长因子II(IGF-II)基因的小干扰RNA(siRNA)序列,构建由重组人甲胎蛋白(hAFP)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)双启动子调控的该siRNA表达载体,观察其对肝癌细胞生长的影响。方法:根据siRNA设计原则,参照IGF-II mRNA序列设计3对siRNA序列及1对阴性对照序列,转染人肝癌Huh7细胞,转染24 h后采用实时荧光定量PCR检测IGF-II mRNA表达量变化,筛选干扰效率最高的siRNA序列。采用PCR扩增出hAFP及hTERT启动子的核心序列,应用基因重组技术构建重组hAFP和hTERT双启动子调控的该siRNA表达载体。将上述siRNA表达载体转染Huh7细胞及L-02人正常肝细胞,观察IGF-II mRNA表达及细胞生长情况变化。结果:实时荧光定量PCR显示,siRNA3在25 nmol/L浓度时抑制效率最高,约90%。成功扩增hAFP及hTERT启动子核心序列,将其分别克隆入pGL3-Basic载体,构建成重组pGL3-hAFP-hTERT载体;将siRNA3克隆至pGL3-hAFP-hTERT载体,构建成重组pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表达载体。Huh7细胞IGF-II mRNA表达量显著降低,抑制效率达86%,细胞增殖受到明显抑制,G1期细胞比例显著增加;L-02细胞上述指标无明显改变。结论:成功构建双重RNA聚合酶II启动子(hAFP及hTERT双启动子)调控的针对IGF-II基因的siRNA表达载体,即pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3;该siRNA表达载体可特异性抑制IGF-II mRNA表达及肝癌细胞生长。

hTERT基因核心启动子调控的TRAIL基因表达载体的构建及对卵巢癌细胞凋亡的影响

目的:构建了人端粒酶逆转录酶(humantelomeraseresersetranscription,hTERT)基因核心启动子调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL)基因真核表达载体并观察其对卵巢癌细胞凋亡的诱导作用。方法:从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增了TRAIL基因片段。测序正确后,利用基因重组方法将TRAIL基因克隆入带有hTERT基因核心启动子pIRES2-EGFP真核表达载体中。获得由hTERT基因核心启动子调控的绿色荧光蛋白和带有效应型TRAIL基因的真核表达载体hTER-Tpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL。用脂质体转染法,将其转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞中,应用RT-PCR法检测转染前后卵巢癌细胞中外源基因的表达情况,以流式细胞术检测TRAIL对卵巢癌细胞的细胞周期的影响及诱导凋亡的作用。结果:经酶切鉴定及测序结果证实,所构建的重组载体正确。转染hTERTpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL载体后,SKOV3细胞的增殖受到抑制,出现明显凋亡。结论:hTERT基因核心启动子在卵巢癌细胞中可特异性地调控其下游TRAIL基因的表达,并发挥其促凋亡作用。构建由hTERT基因核心启动子调控的表达载体,可能是一种新型和有希望的肿瘤治疗的途径。

端粒酶启动子调控tk基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的探讨端粒酶催化亚单位启动子/胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(hTERTp/tk)基因特异载体在体外靶向性杀伤鼻咽癌细胞的效应。方法通过细胞转染将hTERTp/tk转染鼻咽癌细胞株中,采用RT-PCR及MTT法检测hTERTp/tk/pGL3体外特异性杀伤鼻咽癌细胞的效应及其tk基因、端粒酶表达。结果转染hTERTp/tk/pGL3后可见tk基因表达,端粒酶及其hTERT表达较对照组下降。hTERTp/tk/pGL3能特异性杀伤鼻咽癌HNE1细胞,而对正常成纤维细胞无杀伤作用,hTERTp/tk/pGL3杀伤细胞的效应比阳性对照CMV/tk/pGL3的无选择性杀细胞作用略低。结论hTERTp/tk基因特异表达系统具有靶向性杀伤鼻咽癌细胞的作用及抑制肿瘤细胞端粒酶活性。

人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究

目的克隆hTERT启动子,并观察hTERT启动子调控下tk/GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法设计特异性引物,以HepG2基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hTERT启动子;分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体;将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后,通过RT-PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况;用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果成功克隆hTERT上游-280bp^+40bp的核心启动子。RT-PCR和β-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达;hTERT启动子调控的tk/GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞,表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。