PEG10对人类绒毛滋养层细胞系HTR-8/Svneo细胞增殖和凋亡影响的初步研究

目的初步研究父系表达印记基因PEG10低表达对人类绒毛滋养层细胞系HTR-8/Svneo细胞增殖和凋亡的影响。方法构建4组PEG10干扰载体[si-898、si-1854、si-1951及对照(si-NC)],然后转染到HTR-8/Svneo细胞株并进体外培养,si-NC组为对照组。流式细胞术检测HTR-8/Svneo细胞的细胞周期和细胞凋亡,qRT-PCR检测Cytochrome C、Caspase3、Bid、Bak、Bax及Cyclin D1 mRNA的表达情况,MTT法检测细胞增殖活力。结果与对照组比较,转染3组siRNA片段均能显著抑制PEG10基因的表达(P<0.05),其中si-898、si-1854抑制作用更显著(P<0.01)。转染si-898或si-1854的HTR-8/Svneo细胞Cytochrome C、Caspase3、Bid、Bak、Bax mRNA的表达显著升高(P<0.01),而Cyclin D1 mRNA的表达显著降低(P<0.05),并且细胞凋亡率也显著高于对照组(P<0.05)。MTT法检测细胞增殖活力显示,与对照组相比,干扰PEG10基因后细胞在48 h和72 h的增殖活力也显著降低(P<0.05)。流式细胞术检测显示,干扰PEG10基因后细胞周期阻滞在G1期。结论干扰PEG10基因能诱导人类绒毛滋养层细胞系HTR-8/Svneo细胞凋亡,降低细胞增殖活力,阻止细胞周期从G1期到S期的转化进程,导致细胞周期阻滞。

基于死亡受体途径探讨脾肾双补方对离体人早孕绒毛滋养细胞HTR-8凋亡蛋白TNF-α、Caspase-3的影响

目的：探索脾肾双补方对人早孕绒毛滋养细胞中凋亡相关蛋白TNF-α、Caspase-3表达的影响。方法：采用动物含药血清,体外分组培养HTR-8细胞48 h,采用免疫组织化学法检测各组细胞凋亡蛋白TNF-α、Caspase-3表达的情况。结果：与空白对照组比,脾肾双补方高、中剂量组HTR-8细胞凋亡蛋白TNF-α、Caspase-3的表达均降低（P 〈0. 05）,地屈孕酮组HTR-8细胞TNF-α、Caspase-3的表达显著低于空白对照组（P 〈0. 01）;与地屈孕酮组比,脾肾双补方高、中剂量组TNF-α、Caspase-3的表达差异无统计学意义（P〉0. 05）;脾肾双补方高、中剂量组间TNF-α的表达差异无统计学意义（P〉 0. 05）。结论：脾肾双补方含药血清可以促进人早孕绒毛滋养细胞数目增加,其机制可能是：减少人早孕绒毛滋养细胞的凋亡,保护细胞存活,继而有利于早期妊娠的维持,其作用途径可能是：脾肾双补方含药血清通过降低细胞凋亡诱导蛋白TNF-α的表达,抑制死亡受体途径,减少凋亡执行蛋白Caspase-3的表达,从而抑制人早孕绒毛滋养细胞的凋亡,保护细胞存活,维持妊娠。

阿司匹林对缺氧诱导人HTR-8/SVneo滋养细胞凋亡及sFlt-1、HIF-1α表达的影响

目的:探讨阿司匹林对缺氧诱导人HTR-8/SVneo滋养细胞凋亡及可溶性类fms酪氨酸激酶-1(sFLT-1)、低氧诱导因子1α(HIF-1α)表达的影响。方法:人HTR-8/SVneo滋养细胞分为正常对照组、缺氧模型组(2%O_(2)、5%CO_(2)、93%N_(2))、阿司匹林低(0.05mmol/L)、中(0.1mmol/L)、高剂量组(0.2mmol/L);培养结束后,MTT法测定细胞活力,流式细胞仪测定细胞凋亡水平及细胞周期,血清培养基基质胶培养测定细胞血管形成能力,RT-PCR法及蛋白印记法测定细胞sFlt-1、HIF-1α水平。结果:缺氧模型组OD值、存活率、血管形成能力、HIF-1α mRNA和蛋白表达均低于正常对照组及阿司匹林各剂量组,但随着阿司匹林剂量增上述各指标逐渐降低;缺氧模型组凋亡率、G1期、sFlt-1 mRNA和蛋白表达均高于正常对照组和阿司匹林各剂量组,但随着阿司匹林剂量增加凋亡率、G1期、sFlt-1 mRNA和蛋白表达逐渐升高(均P<0.05)。结论:低剂量阿司匹林可促进缺氧环境下HTR-8/SVneo细胞增殖、血管形成,抑制细胞凋亡。其机制可能与低剂量阿司匹林能抑制缺氧环境下HTR-8/SVneo细胞sFlt-1表达,促进HIF-1α表达有关。

MiR-18b-5p对人滋养细胞系HTR-8细胞迁移功能的影响

目的:通过研究子痫前期胎盘组织中低表达的miR-18b-5p(微小RNA18b-5p)对人滋养细胞系HTR-8迁移能力的影响,进一步探讨miR-18b-5p在子痫前期发病过程中的作用。方法:将化学合成的miR-18b-5p inhibitor、miR-18b-5p inhibitor NC,采用瞬时转染的方法将miR-18b-5p inhibitor转入人滋养细胞系HTR-8中设为实验组;miR-18b-5p inhibitor NC转入HTR-8细胞中设为阴性对照组;空白转染组为空白对照组。应用Realtime RT-PCR技术检测各组miR-18b-5p在mRNA水平的表达,同时采用微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统(Transwell实验)检测实验组与对照组细胞迁移能力的变化。结果:Realtime RT-PCR结果显示:转染miR-18b-5p inhibitor后miR-18b-5p的表达量分别与阴性对照组和空白对照组相比明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验结果显示miR-18b-5p inhibitor组与两对照组相比细胞的迁移能力明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:在HTR-8细胞中降调节miR-18b-5p可以显著的降低细胞的迁移能力,推测病理性低表达的miR-18b-5p有可能通过降低滋养细胞的迁移能力,使妊娠早期细胞滋养细胞从固体绒毛顶端迁出减少,导致覆盖合体滋养细胞进而形成具有增殖能力的细胞簇减少,最终造成滋养层浅表植入,从而引起子痫前期的发生。

miR-181a-5p对胎盘滋养层细胞HTR-8/SVneo浸润和迁移的影响及作用机制

目的探讨miR-181a-5p对胎盘滋养层细胞HTR-8/SVneo浸润和迁移能力的影响及其潜在的作用机制。方法在HTR-8/SVneo细胞中,采用Transwell实验检测过表达miR-181a-5p后浸润和迁移能力的变化情况,通过qRT-PCR验证miR-181a-5p的过表达情况,并通过明胶酶谱实验检测过表达miR-181a-5p后MMP-2和MMP-9的表达情况。结果转染miR-181a-5p类似物的HTR-8/SVneo细胞中,发生浸润的细胞数目是对照组的(0. 45±0. 10)倍,迁移的细胞数目是对照组的(0. 58±0. 16)倍(均P <0. 01);实验组MMP-9蛋白表达量(271. 29±0. 11)低于对照组(1 481. 00±0. 16),差异有统计学意义(P <0. 01);实验组MMP-2蛋白表达量(555. 70±0. 09)与对照组(596. 50±0. 13)相比,差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论 miR-181a-5p可能通过降调HTR-8/SVneo细胞中MMP-9的分泌而抑制其浸润和迁移能力。

FABP7在小鼠胎盘组织及人滋养层细胞HTR-8/Svneo中的表达

目的探讨FABP7在正常妊娠小鼠胎盘组织及HTR-8/Svneo细胞中的表达。方法用Realtime-PCR及原位杂交的方法检测Fabp7 mRNA在妊娠小鼠7.5~10.5 d和14.5、18.5 d子宫和胎盘组织中的表达,用冰冻切片免疫荧光的方法检测FABP7蛋白的表达。培养HTR-8/Svneo细胞系,用细胞免疫荧光方法检测FABP7蛋白表达。17β-雌二醇(E2)、孕酮(P4)和E2+P4分别处理小鼠6 h和24 h后,用Realtime-PCR的方法检测小鼠子宫组织中Fabp7 mRNA的表达。结果 Fabp7 mRNA在妊娠小鼠7.5~10.5 d子宫及胎盘组织中均有表达,FABP7蛋白在妊娠小鼠子宫组织蜕膜化细胞及胎盘部位滋养层巨细胞核中有表达;在HTR-8/Svneo细胞中可以检测到mRNA和细胞核中蛋白的表达。P4和E2+P4联合处理6 h及24 h后,Fabp7mRNA在小鼠子宫组织中的表达上调(P<0.05),而E2处理6 h后Fabp7 mRNA表达变化不明显,但24 h后其表达上调(P<0.05)。结论 FABP7在妊娠小鼠子宫蜕膜化细胞、滋养层巨细胞及HTR-8/Svneo细胞中有表达,说明其参与胎盘发育过程,与妊娠的维持有关,且在子宫中的表达量受E2、P4激素的调节。

化瘀消癥颗粒含药血清对HTR-8/SVneo增殖侵袭迁移及FGA、ITGB3表达的影响

目的研究化瘀消癥颗粒含药血清对人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SVneo)增殖、侵袭、迁移以及纤维蛋白原α链(fibrinogen alpha chain,FGA)、整合素β3(integrinβ3,ITGB3)表达的影响。方法CCK8法检测化瘀消癥颗粒含药血清干预HTR-8/SVneo细胞的增殖情况;Transwell、细胞划痕分别检测化瘀消癥颗粒含药血清(低、中、高浓度组)对HTR-8/SVneo细胞侵袭、迁移的影响;qRT-PCR检测FGA、ITGB3 mRNA表达;Western blot检测FGA、ITGB3蛋白表达。结果化瘀消癥颗粒含药血清高、中、低浓度组对HTR-8/SVneo细胞活性具有明显抑制作用。与对照组相比,各剂量化瘀消癥颗粒含药血清组对HTR-8/SVneo细胞增殖活性均有不同程度的抑制作用(P<0.05);不同剂量HTR-8/SVneo细胞穿过Transwell小室滤过膜数量均低于空白组,其中低剂量组HTR-8/SVneo细胞穿膜率最低(P<0.05)。化瘀消癥颗粒含药血清组FGA、ITGB3蛋白表达下调;低浓度化瘀消癥颗粒含药血清组FGA和ITGB3 mRNA表达下调,中、高浓度化瘀消癥颗粒含药血清组ITGB3 mRNA表达下调。结论化瘀消癥颗粒可能通过调控FGA/ITGB3通路抑制HTR-8/SVneo细胞粘附力,从而达到降低细胞活性的目的。

加味宫外孕Ⅱ号方对HTR-8/SVneo细胞内质网应激JNK信号通路的凋亡作用

目的基于内质网应激JNK信号通路研究加味宫外孕Ⅱ号方对滋养细胞凋亡的影响。方法取36只雌性SD大鼠,体重180~220 g,采用随机数字表法分为六组,每组6只,即阴性对照组(中药中剂量等体积的生理盐水),中药低、中、高剂量组[12、24、48 g/(kg·d)],西药组(中药中剂量等体积的生理盐水+肌注甲氨喋呤7.775 mg/kg),中西药结合组(中药中剂量24 g/kg+肌注甲氨喋呤7.775 mg/kg),中药处理8 d后和西药给药1次后采血并分离血清。将不同组别的含药血清分别与HTR-8/SVneo细胞共同培养24 h后,运用Western blot检测IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2、p-JNK蛋白和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA表达情况。另设未用血清处理的细胞作为空白对照组,以排除血清成分复杂所带来的干扰。结果与空白对照组比较,阴性对照组IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2、p-JNK蛋白表达量和IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA表达量无明显变化(P>0.05)。与阴性对照组比较,中药各剂量组、西药组和中西药结合组JNK1、JNK2蛋白表达量无明显变化(P>0.05),而IRE1α、TRAF2、ASK1、p-JNK蛋白和IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA表达量均增加,差异均有统计学意义(均P<0.05);中药高剂量组IRE1α、TRAF2、p-JNK蛋白和IRE1α、TRAF2、JNK1、JNK2 mRNA表达量均高于中药中、低剂量组,差异均有统计学意义(均P<0.05);中药中剂量组IRE1α、ASK1、p-JNK蛋白和IRE1α、ASK1、JNK1 mRNA表达量均高于中药低剂量组,差异均有统计学意义(均P<0.05);与中药高剂量组比较,西药组和中西药结合组IRE1α、ASK1、p-JNK蛋白和IRE1α、JNK1 mRNA表达量均增加,差异均有统计学意义(均P<0.05);与西药组比较,中西药结合组IRE1α蛋白和IRE1α、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA表达量无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),ASK1蛋白表达量增加,而TRAF2、p-JNK蛋白表达量和TRAF2 mRNA表达量均减少,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论加味宫外孕Ⅱ号方能引发内质网过度应激并激活JNK信号通路,进而促使细胞凋亡,且可能存在剂量相关性。

PTEN/mTOR通路在高糖诱导的人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo凋亡中的作用机制探讨

目的探讨高糖诱导人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo凋亡的相关机制。方法体外培养人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo,分为空白对照组、高糖组、NC组(阴性对照组)、第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(PTEN)-siRNA组(抑制PTEN表达组)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路抑制剂(GDC-0349)组。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测HTR-8/SVneo细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白及PTEN/mTOR通路相关蛋白表达情况。结果与空白对照组比较,高糖组HTR-8/SVneo细胞增殖抑制率、凋亡率及Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)、PTEN蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(p-PI3K)/PI3K、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)/AKT、磷酸化mTOR(p-mTOR)/mTOR蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与高糖组、NC组比较,PTENsiRNA组HTR-8/SVneo细胞增殖抑制率、凋亡率及Bax、cleaved caspase-3、PTEN蛋白表达水平均显著降低,Bcl-2、pPI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与PTEN-siRNA组比较,GDC-0349组HTR-8/SVneo细胞增殖抑制率、凋亡率及Bax、cleaved caspase-3蛋白表达水平均显著升高,Bcl-2、p-PI3K/PI3K、pAKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论高糖可抑制人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo增殖能力,诱导其凋亡,可能是通过上调PTEN表达、抑制PI3K/AKT/mTOR通路活化实现的。

PGRN在植入性胎盘组织中的表达及其对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo迁移、侵袭的影响

目的:探讨颗粒蛋白前体(PGRN)在植入性胎盘组织中的表达以及PGRN对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo迁移、侵袭的影响及潜在的作用机制。方法:收集河北省中医院收治的植入性胎盘组织和正常胎盘组织各25例,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)检测胎盘组织(绒毛膜层)中PGRN mRNA和蛋白水平;体外培养人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo,采用重组腺病毒载体和小干扰RNA(siRNA)技术过表达和干扰HTR-8/SVneo细胞中的PGRN,通过qRT-PCR和Western Blot检测细胞中PGRN表达确定过表达和干扰有效后,划痕实验和Transwell实验分别检测HTR-8/SVneo细胞迁移、侵袭能力;Western Blot检测HTR-8/SVneo细胞迁移、侵袭相关蛋白的表达。结果:植入性胎盘组织中PGRN mRNA和蛋白表达水平均显著高于正常胎盘组织(P<0.05);过表达PGRN后,HTR-8/SVneo细胞迁移、侵袭能力显著增加(P<0.05),N-钙黏蛋白(N-cadherin)、纤维连接蛋白(FN)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达水平显著升高,E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达水平显著降低(P<0.05),而PGRN沉默后,HTR-8/SVneo细胞的迁移、侵袭能力显著降低(P<0.05),同时N-cadherin、FN、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著降低,E-cadherin蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。结论:PGRN在植入性胎盘组织中过表达,PGRN的过表达可能促进人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo的迁移和侵袭;而下调PGRN的表达能抑制人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo的迁移和侵袭;其作用机制可能与促进上皮-间质转化(EMT)过程有关。

基于JAK1/STAT3信号通路探讨寿胎丸含药血清对人绒毛膜滋养层细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的观察寿胎丸含药血清对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo增殖、侵袭和迁移的影响,基于Janus激酶1(JAK1)/信号转导和转录激活因子3(STAT3)通路探讨其作用机制。方法制备寿胎丸含药血清及空白血清,体外培养HTR-8/Svneo细胞,将细胞分为对照组和寿胎丸低、中、高剂量组,分别用空白血清及2.5%、5%、10%含药血清处理细胞,CCK8法检测细胞存活率,划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot检测HTR-8/Svneo细胞JAK1/STAT3通路相关蛋白及增殖相关蛋白Ki67、血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)-2、基质金属蛋白酶(MMP)-9、微染色体维持蛋白2(MCM2)、增殖核抗原(PCNA)表达,RT-PCR检测Ki67、PCNA mRNA表达。结果与对照组比较,寿胎丸低、中、高剂量组细胞存活率显著升高,且作用36 h细胞存活率最高(P<0.05,P<0.01),寿胎丸中、高剂量组细胞划痕愈合率显著升高(P<0.05,P<0.01),寿胎丸低、中、高剂量组细胞迁移率及侵袭率显著升高(P<0.01),寿胎丸高剂量组细胞p-JAK1、p-STAT3蛋白表达显著升高(P<0.05),寿胎丸中、高剂量组细胞Ki67、VEGFR-2、MMP-9、MCM2、PCNA蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01),寿胎丸低、中、高剂量组细胞Ki67、PCNA mRNA表达显著升高(P<0.05,P<0.01),以寿胎丸高剂量组作用最显著(P<0.05,P<0.01)。结论寿胎丸含药血清能提高HTR-8/Svneo细胞增殖、侵袭和迁移能力,其机制可能与激活JAK1/STAT3信号通路有关。

microRNA-186-5p靶向KLOTHO调控绒毛外滋养细胞侵袭功能的机制研究

目的探讨miR-186-5p通过靶向KLOTHO参与滋养细胞侵袭调控的机制。方法收集2018年6月-2019年6月在武汉大学人民医院妇产科剖宫产的35名子痫前期孕妇及20名正常孕妇的胎盘组织及外周血样本。利用qRT-PCR检测子痫前期及正常胎盘组织miR-186-5p表达水平。取绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo分组转染,Transwell小室法检测侵袭能力,双荧光素酶报告基因实验验证miR-186-5p与KLOTHO的靶向关系,应用受试者工作特征(ROC)曲线分析外周血miR 186-5p预测子痫前期发生的价值。结果子痫前期孕妇胎盘组织miR-186-5p表达水平明显高于正常胎盘组织,过表达的miR-186-5p显著抑制HTR-8/SVneo细胞侵袭能力,双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-186-5p与KLOTHO直接靶向结合,ROC曲线分析显示,外周血miR-186-5p诊断子痫前期的最佳截断值为2.05,曲线下面积为0.842(95%CI:0.733~0.951),敏感度、特异性分别为80%、76%。结论miR-186-5p可靶向KLOTHO调节滋养细胞侵袭能力,为子痫前期发病机制的研究提供了新线索。

加味宫外孕Ⅱ号方对人绒毛膜滋养层细胞凋亡的影响

目的探讨加味宫外孕Ⅱ号方含药血清诱导人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SVneo)凋亡的机制。方法36只大鼠随机分为阴性对照组,中药低、中、高剂量组,西药(甲氨蝶呤)组,中西药结合组,每组6只,各组给予相应的药物处理,于第8天给药1 h后心脏采血,制备空白血清及含药血清。各组血清与HTR-8/SVneo细胞共培养24 h,同时设置仅添加培养基处理的HTR-8/SVneo细胞作为空白对照组,流式细胞术检测细胞早、晚期凋亡率及胞浆内游离Ca^(2+)水平,Western blot和RT-qPCR法检测细胞钙蛋白酶1(calpain-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(caspase-12)蛋白及mRNA相对表达量。结果与阴性对照组比较,各给药组细胞凋亡率、胞浆内Ca^(2+)水平、calpain-1、caspase-12蛋白及mRNA表达均升高(P<0.05),且中药各剂量组作用呈剂量依赖性(P<0.05),其中中药高剂量组作用优于西药组和中西药结合组(P<0.05)。结论加味宫外孕Ⅱ号方能够诱导人绒毛膜滋养层细胞凋亡,并呈剂量依赖性,其机制可能与激活内质网应激caspase-12信号通路,增加细胞胞浆内游离Ca^(2+)水平,上调calpain-1和caspase-12表达有关。

CircACTR2调节miR-23a-3p/TBL1X轴对高糖诱导的滋养层细胞损伤的影响

目的探讨环状RNA肌动蛋白相关蛋白2(circACTR2)调节miR-23a-3p/转导素β1X连锁蛋白(TBL1X)轴对高糖诱导的滋养层细胞损伤的影响。方法将人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo分为NG组(5.5 mmol/L葡萄糖)、HG组(25 mmol/L葡萄糖)、si-NC组(25 mmol/L葡萄糖+转染si-NC)、si-circACTR2组(25 mmol/L葡萄糖+转染si-circACTR2)、si-circACTR2+inhibitor-NC组(25 mmol/L葡萄糖+si-circACTR2和inhibitor-NC共转染)、sicircACTR2+miR-23a-3p inhibitor组(25 mmol/L葡萄糖+si-circACTR2和miR-23a-3p inhibitor共转染)。实时荧光定量PCR(qPCR)检测细胞中circACTR2、miR-23a-3p的表达;CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;划痕实验检测细胞迁移;酶联免疫吸附试验检测丙二醛(MDA)水平和乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性;Western blot检测细胞中TBL1X、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、胱天蛋白酶3(caspase-3)的表达。双萤光素酶报告基因实验分别验证circACTR2、TBL1X和miR-23a-3p的靶向关系。结果与NG组相比,HG组HTR-8/Svneo细胞miR-23a-3p表达、增殖能力、划痕愈合率、PCNA、MMP-2、MMP-9表达、SOD活性降低,circACTR2、TBL1X和caxpase-3表达、MDA含量、LDH活性、凋亡率升高(P<0.05);与HG组和si-NC组相比,si-circACTR2组HTR-8/Svneo细胞中miR-23a-3p表达、增殖能力、划痕愈合率、PCNA、MMP-2、MMP-9表达、SOD活性升高,circACTR2、TBL1X和caxpase-3表达、MDA含量、LDH活性、凋亡率降低(P<0.05);在敲低circACTR2的基础上,下调miR-23a-3p可明显减弱circACTR2敲低对高糖诱导的HTR-8/Svneo细胞的增殖和迁移的促进作用,增强细胞凋亡和氧化应激能力。双萤光素酶报告基因实验结果显示,circACTR2靶向负调控miR-23a-3p表达,miR-23a-3p靶向负调控TBL1X表达。结论敲低circACTR2可调控miR-23a-3p/TBL1X轴,进而通过抑制高糖诱导的滋养层细胞损伤来发挥保护作用。

miR-101通过调控内质网蛋白44调节子痫前期内质网应激诱导的滋养细胞凋亡

目的:探讨人类子痫前期(PE)中miR-101介导的内质网蛋白44(ERp44)对滋养细胞凋亡和内质网应激过程的调控。方法:采用实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测25例PE和25例正常孕妇胎盘组织中miR-101的表达水平,分析ERp44与miR-101表达的相关性。分别过表达和封闭miR-101表达后,采用Western blot法检测ERp44的表达,采用流式细胞技术检测滋养细胞的凋亡数量改变,采用Western blot法检测内质网应激相关的凋亡蛋白的表达情况。结果:(1)PE胎盘中miR-101表达下调,低于正常妊娠组的25%(P<0.05);miR-101表达与ERp44呈显著负相关(Pearson相关系数=-0.826,P<0.01);(2)滋养细胞HTR-8/SVneo中过表达miR-101后,ERp44表达下调约50%(P<0.01);封闭miR-101表达后,ERp44表达升高2.39倍(P<0.01);(3)过表达miR-101,细胞凋亡数量减少,同时通过靶向结合ERp44而抑制内质网应激诱导的凋亡蛋白反应;封闭miR-101表达,细胞凋亡数量增加,内质网应激诱导的凋亡蛋白反应增加。结论:PE中miR-101通过靶向调节ERp44参与内质网应激诱导的滋养细胞凋亡过程。

高糖诱导滋养层细胞内质网应激及凋亡

目的探讨高糖对滋养层细胞系HTR-8内质网应激及凋亡的影响。方法用不同浓度的含糖培养基培养人滋养层细胞系HTR-8细胞24小时,实时定量PCR检测细胞中内质网应激相关分子CHOP、GRP78、ATF6、XBP-1 mRNA的表达水平;Western blot检测CHOP、GRP78蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞早期凋亡率。结果实时定量PCR结果显示,与正常血糖及渗透压对照组相比,高糖组CHOP及XBP-1 mRNA表达水平显著升高,GRP78 mRNA表达降低,ATF6表达无差异;Western blot检测显示,CHOP蛋白表达水平升高,GRP78蛋白表达水平降低;流式细胞术检测显示,高糖组细胞早期凋亡率增加。正常血糖组与渗透压对照组相比,CHOP、GRP78、ATF6、XBP-1 mRNA、蛋白表达水平及细胞早期凋亡率均无差异。结论高糖能激活滋养层细胞HTR-8内质网应激,并诱导细胞凋亡。

Klotho对滋养细胞侵袭的影响

目的:研究Klotho对绒膜外滋养细胞系HTR8/SVneo侵袭的影响。方法:用免疫组化检测子痫前期及正常孕妇胎盘组织Klotho蛋白表达情况。实验分组为对照组、Klotho重组蛋白组、Klotho siRNA组。Transwell小室法检测侵袭能力,Western Blot检测细胞蛋白表达水平。结果:子痫前期胎盘组织Klotho表达水平明显低于正常胎盘组织。Klotho重组蛋白处理细胞后,HTR8/SVneo细胞侵袭能力显著增强、其表达的基质金属蛋白酶2(MMP-2)及基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达上调。Klotho siRNA处理细胞后,HTR8/SVneo细胞侵袭能力显著减弱、其表达的MMP-2及MMP-9表达显著下调。结论:Klotho可能通过介导MMP-2和MMP-9的表达调节滋养细胞侵袭能力,为子痫前期发病机制的研究提供了新线索。

β淀粉样蛋白1-42对滋养细胞迁移和侵袭的影响

目的探讨β淀粉样蛋白1-42对人滋养细胞系HTR-8/SVneo迁移和侵袭能力的影响。方法采用HTR-8/SVneo细胞系,实验分为对照组、Aβ1-42组及Aβ1-42+抗Aβ1-42抗体组。Transwell迁移及侵袭试验检测细胞迁移及侵袭能力;Western blot检测蛋白表达水平。结果 Aβ1-42(10μmol/L)处理细胞后,细胞活力显著降低,细胞迁移及侵袭能力减弱,N-cadherin、vimentin蛋白表达水平下调,细胞培养上清液中MMP-2、MMP-9表达水平及活性均显著下降;同时给予1:750稀释抗Aβ1-42抗体处理后,细胞迁移及侵袭能力,N-cadherin、vimentin蛋白表达水平,MMP-2、MMP-9表达水平及活性均显著上升。结论 Aβ1-42抑制滋养细胞迁移、侵袭的能力,可能导致子宫螺旋动脉血管重铸障碍。

全反式维甲酸通过调控sFlt-1表达对滋养层细胞侵袭及促血管形成能力的影响

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)对可溶性血管内皮生长因子受体1(sFlt-1)的调控作用及其对人胎盘滋养层细胞侵袭及促血管形成能力的影响。方法采用0.15μmol/L ATRA处理HTR-8/SVneo细胞12、24、48、72 h,RT-PCR和ELISA分别检测细胞中sFlt-1 mRNA以及上清液中sFlt-1蛋白水平。采用携带sFlt-1过表达载体慢病毒感染HTR-8/SVneo细胞,并采用0.15μmol/L ATRA处理24 h,采用ELISA检测细胞上清液中sFlt-1、胎盘生长因子(PIGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白含量;Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力;小管形成实验检测细胞体外促血管形成能力;Western blot检测细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9蛋白表达水平。结果 ATRA可呈时间依赖性的抑制HTR-8/SVneo细胞中sFlt-1 mRNA表达及其蛋白的分泌;ATRA干预后,HTR-8/SVneo细胞上清液中sFlt-1蛋白水平降低(P <0.05),PIGF和VEGF蛋白水平升高(P <0.05),而细胞侵袭和迁移能力、血管成管数目以及MMP-9和MMP-2蛋白表达水平均增加(P <0.05)。然而,sFlt-1过表达可抑制ATRA对HTR-8/SVneo细胞的干预效果。结论ATRA可通过抑制sFlt-1表达增强滋养层细胞侵袭及促血管形成能力。

加味宫外孕Ⅱ号方对人滋养叶细胞Caspase-12通路影响的研究

目的观察加味宫外孕Ⅱ号方对人滋养叶细胞内质网应激Caspase-12信号通路凋亡相关蛋白Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3水平的影响及细胞超微结构变化,探讨其治疗异位妊娠的作用机制。方法将SD大鼠分为阴性对照组(B组)、低、中、高剂量中药组(C组、D组、E组)、甲氨蝶呤组(F组)、中西药结合组(G组),予相应药物处理后取血制备含药血清,将各组含药血清分别作用于HTR-8/SVneo细胞24 h,并设置未用含药血清处理的细胞作为空白对照组(A组)。采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)与实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测HTR-8/SVneo细胞中凋亡基因Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3蛋白及mRNA的表达水平;采用透射电镜观察细胞超微结构的变化。结果(1)Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3蛋白水平及mRNA相对表达量:A组与B组比较无差异(P>0.05);与B组比较,C组Caspase-7 mRNA、Caspase-9蛋白及Caspase-3蛋白与mRNA表达均上调明显(P<0.05),而Caspase-7蛋白、Caspase-9 mRNA表达无差异(P>0.05);D、E、F、G组Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3蛋白及mRNA表达量均较B组明显上调(P<0.05);E组较D组上调明显(P<0.05);E组与F组比较,Caspase-7、Caspase-9蛋白与mRNA及Caspase-3蛋白表达上调明显(P<0.05);E组与G组比较,Caspase-9蛋白与mRNA及Caspase-3蛋白表达上调明显(P<0.05);F组与G组比较无差异(P>0.05)。(2)透射电镜结果显示:A组与B组细胞染色质均匀散布于核膜内,细胞内质网、线粒体、高尔基体清晰可见;与B组比较,C、D、E、F、G组细胞微绒毛减少,染色质固缩,异染色质边缘化,部分线粒体肿胀、脊紊乱或断裂、甚至消失,线粒体空泡化等典型的凋亡特征改变。结论加味宫外孕Ⅱ号方可能通过激活内质网应激Caspase-12信号通路,破坏滋养叶细胞的形态学结构,上调Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3凋亡相关基因的表达,促进滋养叶细胞凋亡。