清热祛瘀固肾方对anti-β2GPI诱导下的滋养层细胞TLR4/MyD88信号通路的影响

[目的]以Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化因子(myeloid differentiation factor88,My D88)通路为切入点,探讨清热祛瘀固肾方(简称清固方)对抗β2糖蛋白I抗体(anti-beta 2 glycoprotein I antibody,anti-β2GPI)诱导的人胎盘滋养层细胞HTR8损害的作用及机理。[方法]将40只雌性Wistar大鼠,随机分为清固方高、中、低剂量组和正常组。分组用药10d后心脏取血,分别制备含不同浓度清固方血清和正常血清。构建My D88和TLR4真核表达质粒,分别转染HTR8细胞。两组HTR8细胞各分成清固方高、中、低剂量组、肝素组、阴性对照组和空白对照组。阴性对照组及空白对照组给予正常血清,其它组则给予相应的含药血清干预。除空白对照组外,其它各组与小鼠单克隆anti-β2 GPI共孵育后采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养上清液中单核细胞趋化因子-1(monocyte hemotactic protein-1,MCP-1)、白细胞介素-1β(interleukin-1beta,IL-1β)浓度。[结果]经anti-β2GPI诱导的转染TLR4真核表达质粒的HTR8细胞经各组含药血清处理后,清固方高、中、低剂量组IL-1β浓度低于肝素组和阴性对照组,清固方高剂量组及空白对照组MCP-1浓度低于肝素组,差异有统计学意义(P<0.05);转染My D88真核表达质粒的HTR8细胞经各组含药血清处理后,清固方高、中、低剂量组及空白组对照IL-1β、MCP-1浓度低于肝素组,阴性对照组IL-1β、MCP-1浓度高于其他各组,差异有统计学意义(P<0.05)。清固方高、中、低剂量组、肝素组总凋亡率均低于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01),空白对照组总凋亡率低于其他各组,差异有统计学意义(P<0.01)。[结论]清固方通过干预TLR4/My D88信号转导通路,抑制HTR8细胞表面β2-GPI/anti-β2GPI活化引起的IL-1β、MCP-1分泌和细胞凋亡。

基于VEGF调控SDF-1/CXCR4信号探讨可乐定促进滋养细胞的增殖和迁移

目的探讨可乐定(CLO)对滋养细胞增殖、迁移的促进作用及分子机制探讨。方法不同浓度的CLO与HTR8-SVneo滋养细胞共培养,MTT和Transwell方法检测HTR8-SVneo细胞的增殖和迁移,RT-PCR和Western blot技术检测血管内皮生长因子(VEGF)、基质细胞衍生因子(SDF-1)及其趋化因子受体(CXCR4)的表达水平;将CLO分别与VEGF受体抑制剂(DC101)、CXCR4抑制剂(AMD3100)共同作用于HTR8-SVneo细胞,检测细胞的增殖、迁移能力和CXCR4的表达水平。结果 CLO显著促进HTR8-SVneo细胞的增殖和迁移(P<0.05),并上调VEGF、CXCR4的表达水平(P<0.05);抑制剂DC101和AMD3100均可抑制可乐定对滋养细胞增殖和迁移的促进作用,且VEGF可调控SDF-1、CXCR4的表达(P<0.05)。结论 CLO可通过VEGF激活SDF-1/CXCR4信号,促进HTR8-SVneo滋养细胞的增殖和迁移。

体外缺氧诱导子痫前期滋养细胞模型优化及代谢组学鉴定

目的:探讨滋养细胞体外缺氧不同处理方法模拟子痫前期模型的优化研究。方法:HTR8/SVneo滋养细胞分别在1%O2(缺氧环境)和21%O2(常氧环境)培养箱中培养1 h(记为H1、N1)或2 h(记为H2、N2),缺氧1 h后复氧1 h(记为H1R1)和缺氧2 h后复氧2 h(记为H2R2),H1R1后再缺氧1 h(记为H1R1H1),H2R2后再缺氧2 h(记为H2R2H2),H1R12个循环(记为H1R1H1R1)和H2R22个循环(记为H2R2H2R2),缺氧2 h后复氧6 h(记为H2R6),持续缺氧24 h,以及持续常氧4 h(记为N4)、8 h(记为N8)和24 h(记为Normoxia),然后提取蛋白以Western blot检测腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化水平,以验证各组处理对于诱导滋养细胞能量应激的效果;HTR8/SVneo滋养细胞在常氧或者缺氧环境培养24 h后经气相质谱技术(gas chromatography mass spectrum,GS-MS)进行细胞代谢组学分析,以验证AMPK磷酸化水平上调是否与滋养细胞代谢组变化具有一致性。结果:缺氧组AMPK的活性(1.615±0.111)明显高于常氧组(1.000±0.107)和缺氧复氧组(1.277±0.113);缺氧时显著增加的代谢物有4-甲基-2-戊酮酸(log22.597为1.377)、水合乙醛酸(log22.483为1.312)、组氨酸(log21.188为0.248)、苯丙氨酸(log21.262为0.335)、缬氨酸(log21.518为0.602)、正亮氨酸(log21.519为0.603)、乙酰丝氨酸(log21.691为0.758)、丝氨酸(log21.783为0.834)、半胱氨酸(log21.851为0.889)、蛋氨酸(log22.072为1.051)、鸟氨酸(log22.251为1.170)等;而棕榈反油酸(log20.127为-2.983)、11,14,17-廿碳三烯酸(log20.334为-1.583)、二十四单烯酸(log20.600为-0.738)、共轭亚油酸(log20.680为-0.557)、顺式十八碳烯酸(log20.711为-0.492)、9-十七碳烯酸(log20.782为-0.355)、二十二碳六烯酸(log20.829为-0.271)、二十碳五烯酸(log20.841为-0.250)、芥酸(log20.844为-0.244)、二十二碳五烯酸(log20.898为-0.156)、柠檬酸(log20.279为-1.842)、苹果酸(log20.208为-2.264)、琥珀酸(log20.254为-1.980)、顺乌头酸(log20.260为-1.946)、β-柠檬酸-左旋谷氨酸(log20.093为-3.430)、β-丙氨酸(log20.139为-2.851)、胱硫醚(log20.267为-1.904)、顺式-4-羟脯氨酸(log20.500为-1.000)等在缺氧时显著降低。代谢途径结果分析显示缺氧时滋养细胞中核苷酸代谢[log2(1.811、1.149)分别为0.857、0.201]、能量代谢[log2(1.510、1.173、1.149)分别为0.595、0.230、0.201]、维生素代谢[log2(1.045、1.052、1.125)分别为0.064、0.073、0.170]、氨基酸代谢[log2(1.245、1.020、1.027、1.123、1.127、1.076)分别为0.316、0.028、0.039、0.167、0.173、0.106]、信号转导(log21.046为0.065)、蛋白翻译(log21.026为0.037)等途径被激活,而碳水化合物[log2(0.857、0.857、0.799)分别为-0.222、-0.222、-0.323]、脂肪酸[log2(0.944、0.912、0.826)分别为-0.083、-0.133、-0.276]、内分泌代谢[log2(0.885、0.799、0.799)分别为-0.176、-0.323、-0.323]和其他第二代谢物生物合成[log2(0.947、0.871、0.743)分别为-0.079、-0.199、-0.428]等代谢途径显著受到抑制。结论:单纯缺氧模型更适合用于子痫前期病理生理机制的体外研究。

环状RNA circVCAN对胎盘滋养细胞增殖、侵袭及自噬的影响

目的探讨环状RNA circVCAN(hsa-circ-0073239)在胎儿生长受限(fetal growth restriction, FGR)胎盘组织中的表达、功能及潜在作用机制。方法收集重庆医科大学附属第二医院妇产科2018年1月~2018年12月收治的12例FGR及12例正常孕妇的胎盘组织标本,采用实时荧光定量PCR检测胎盘组织中circVCAN的表达,培养人胎盘滋养细胞系HTR8/Svneo,用circVCAN干扰及过表达质粒分别转染HTR8/Svneo细胞,采用EdU、流式细胞仪、Transwell实验检测细胞增殖、凋亡、侵袭能力的变化,用蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG5、ATG7的表达情况。结果 circVCAN、ATG5、ATG7及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在FGR胎盘组织中的表达均较正常组显著增高(P<0.05)。FGR组孕妇终止妊娠孕周较正常妊娠组早(P<0.05),FGR胎儿出生体质量、胎盘质量显著轻于正常妊娠组(P<0.01,P<0.05),FGR胎儿出生身长明显短于正常胎儿(P<0.01)。沉默circVCAN后HTR8/Svneo细胞增殖、侵袭能力增强(P<0.01),过表达circVCAN后HTR8/Svneo细胞增殖、侵袭能力减弱(P<0.01),凋亡差异均无统计学意义(P>0.05)。沉默circVCAN的HTR8/Svneo细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG5、ATG7表达均降低(P<0.05),过表达circVCAN的HTR8/Svneo细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG5、ATG7表达均升高(P<0.05)。结论 circVCAN在FGR胎盘组织中呈高表达,circVCAN对凋亡无影响,但可抑制胎盘滋养细胞的增殖、侵袭,可能通过促进ATG5、ATG7的表达而增强自噬。

瘦素对HTR8-SVneo细胞增殖的影响及调控机制

目的研究瘦素(Leptin)对HTR8-SVneo滋养细胞系增殖的影响及对DNA结合和分化抑制剂(ID)分子表达水平的影响,探讨Leptin对HTR8-SVneo细胞增殖作用的调节机制。方法体外培养HTR8-SVneo滋养细胞,MTT法检测Leptin不同质量浓度(0、10、50、100、250、500 ng/mL)刺激后细胞增殖情况。HTR8-SVneo细胞培养体系中加入Leptin(0、100、500 ng/mL),RT-PCR检测瘦素受体(Leptin R)各亚型表达,实时定量PCR检测ID分子表达,Western Blot检测ID2表达。SiRNA干扰ID2分子后,分为Leptin(0 ng/mL)、Leptin(100 ng/mL)、Leptin(500 ng/mL)、Leptin(0 ng/mL)+ID2-siRNA、Leptin(100 ng/mL)+ID2-siRNA、Leptin(500 ng/mL)+ID2-siRNA,MTT检测Leptin对HTR8-SVneo滋养细胞增殖的影响。结果与Leptin(0 ng/mL)比较,高质量浓度Leptin(100、250、500 ng/mL)促进HTR8-SVneo细胞增殖(P<0.05);HTR8-SVneo细胞表达除HuB219.2外的全部受体亚型;Leptin以剂量依赖方式促进HTR8-SVneo细胞ID2分子及OB-RL表达(P<0.05);ID2-siRNA抑制ID2表达并逆转Leptin对滋养细胞增殖的促进作用。结论 Leptin可能通过Leptin R-ID2途径促进HTR8-SVneo细胞增殖,为阐明滋养细胞增殖调控机制提供了新的基础数据。

高糖抑制滋养层细胞表面微绒毛的形成及其机制

目的:探究高糖对滋养层细胞微绒毛形态的影响及分子机制。方法:透射电镜观察足月妊娠的糖尿病和正常血糖孕妇胎盘组织合体滋养层细胞表面微绒毛形态的改变;分别于静态及流体环境下培养人滋养层细胞系HTR8/SVeno 24 h,扫描电镜观察细胞表面微绒毛变化。扫描电镜观察单侧流体培养环境下高糖组(16.6 mmol/L葡萄糖)与对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)细胞表面微绒毛形态的变化;Western Blot检测流体环境下实验组和对照组细胞中ROCK2及P-Akt、P-Ezrin、P-PI3K、P-Confilin的蛋白表达水平。结果:娠糖尿病孕妇足月妊娠胎盘组织的滋养层细胞表面微绒毛较正常妊娠者短小、排列紊乱、稀疏。与静态培养相比,单侧流体培养滋养层细胞表面微绒毛长度增加(P<0.01)。流体环境下,实验组HTR8细胞表面微绒毛较对照组长度缩短(P<0.001)。实验组与对照组比较,HTR8细胞中Akt、Ezrin磷酸化水平下降(P<0.01,P<0.01),PI3Kp85磷酸化水平升高(P<0.001),ROCK2蛋白表达水平下降(P<0.05),Confilin磷酸化水平下降(P<0.01)。结论:单侧流体培养促进滋养层细胞表面微绒毛生长。高浓度的葡萄糖抑制HTR8/SVeno细胞表面微绒毛的生长。高浓度的葡萄糖对HTR8/SVeno细胞微绒毛的影响可能是通过调控Akt、PI3K和ROCK2相关信号通路、调节细胞骨架相关蛋白Ezrin、confilin及Factin的表达实现的。