环状RNA circRSF1结合HuR促进辐射诱导的肝星状细胞炎性表型

目的探讨环状RNA circRSF1能否通过结合HuR蛋白并阻遏其功能发挥,进而调控辐射诱导的肝星状细胞(HSC)炎性表型。方法在人HSC细胞株LX2过表达或敲低HuR后给予8 Gy X射线照射。通过qRT-PCR检测炎性因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表达,采用Western blot检测IκBα表达和NF-κB磷酸化。采用RNA pull down和RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)验证circRSF1与HuR的结合。改变circRSF1和HuR的作用水平后检测炎性因子和IκBα的表达以及NF-κB的磷酸化。结果敲低HuR可明显上调受照的LX2中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,并减少IκBα表达和促进NF-κB磷酸化,而过表达HuR则相反(P<0.05)。过表达或敲低circRSF1对HuR的表达无影响。RNA pull down和RIP实验证实了两者存在相互结合。过表达circRSF1减少HuR与IκBα结合并下调IκBα的表达(P<0.05)。过表达circRSF1联合过表达HuR可部分逆转过表达circRSF1所致的LX2受照后炎性因子表达上调、IκBα表达下调以及NFκB磷酸化增加,而敲低circRSF1联合敲低HuR的效应则相反(P<0.05)。结论circRSF1通过结合HuR降低IκBα表达,促进NF-κB通路激活,从而促进辐射诱导的HSC炎性表型。

四君子汤含药血清对IEC-6细胞增殖多胺/HuR信号通路的影响

目的研究四君子汤(Sijunzi decoction-containing serum,)对小肠上皮细胞(IEC-6)增殖多胺/HuR信号通路生长相关基因蛋白表达及细胞周期的影响,探讨其对肠黏膜损伤修复的机制。方法SD大鼠制备四君子汤含药血清(Sijunzi decoction-containing serum,SJZD),免疫荧光法及免疫印迹法分析HuR蛋白在胞浆及胞核表达情况,RT-PCR法检测激活转录因子2(activating transcription factor-2,ATF-2),JunD,周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)mRNA表达,免疫印迹法检测HuR、ATF-2、JunD及CDK4蛋白表达,流式细胞仪分析细胞周期分布。结果与空白组比较,SZJD组ATF-2及JunD mRNA及蛋白表达降低,CDK4 mRNA及蛋白表达升高,G_(0)/G_(1)期细胞占比减少,S期细胞占比增加;α-二氟甲基鸟氨酸(DFMO)组细胞核HuR蛋白水平减少,细胞浆HuR蛋白水平增加,ATF-2及JunD mRNA及蛋白表达上调,Cdk4 mRNA及蛋白表达下调,G_(0)/G_(1)期细胞占比增加,S期细胞占比减少;SJZD组可拮抗DFMO的上述作用。结论SJZD作用于肠上皮细胞多胺/HuR信号通路,影响生长相关基因蛋白ATF-2、JunD及CDK4表达,可能是其促进肠黏膜损伤修复的机制之一。

MiR-155对HuR的调控与结肠癌细胞的转移机制研究

目的:探讨MiR-155通过对HuR的调控参与结肠癌细胞转移的机制。方法:研究使用HCT-116结肠癌细胞系,分为miR-155模拟物和miR-155抑制剂、miRNA模拟物阴性对照和miRNA抑制物阴性对照组。MTT、伤口愈合试验、菌落形成测定、细胞周期分析和流式细胞术测定检测细胞活力、周期、迁移和凋亡。qPCR和蛋白质印迹法测量细胞中细胞miR-155的表达水平,蛋白质印迹法测量细胞中细胞HuR的表达水平,荧光素酶报告基因测定相关靶点。结果:与对照组比较,用miR-155模拟物转染后,miR-155水平升高;转染miR-155模拟物72h后细胞活力增加,菌落数增加,miR-155模拟物增加了S期细胞的百分比,miR-155模拟物抑制结肠癌细胞的凋亡,转染miR-155模拟物的细胞的迁移率增加,明确miR-155模拟物促进了结肠癌细胞的迁移。用miR-155抑制剂转染后,结果相反。用miR-155抑制剂转染后HuR的mRNA水平降低,转染miR-155模拟物后,HuR的mRNA水平升高。荧光素酶报告基因测定miR-155与HuR的3′UTR结合,并且HuR是miR-155的直接靶标。结论:结果表明miR-155促进结肠癌细胞增殖,增强其集落形成能力,促进其细胞周期进程,抑制细胞凋亡,促进了结肠癌细胞的迁移。HuR被确定为miR-155的新靶点。

RNA结合蛋白HUR在消化系统肿瘤中的研究进展

消化系统肿瘤是我国常见的恶性肿瘤,有较高的发病率及病死率,早期症状不明显及诊断和治疗的局限性使很多患者确诊时已为中晚期。人抗原R蛋白(human antigen R,HUR)是胎盘致死性异常视觉基因(embryonic lethal abnormal vision,ELAV)家族中四大成员之一,是转录后基因表达的调控因子。多项研究发现HUR在消化系统肿瘤如食管癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌及结直肠癌中过表达并与患者预后不良及患者对放化疗敏感性高密切相关。本文综述HUR的生物学功能及其在消化系统肿瘤中的作用。

HuR和COX-2蛋白表达与宫颈癌手术预后的关系

目的探讨和评价HuR和COX-2蛋白表达与宫颈癌手术预后的关系。方法采用免疫组化方法检测101例原发性宫颈癌组织中HuR及COX-2蛋白的表达;采用Kaplan-Meier法分析二者表达与宫颈癌预后的关系。结果 101例宫颈癌组织中HuR蛋白的阳性表达率为47.50%(48/101),HuR蛋白的阳性表达率在不同的临床分期、癌灶大小及有无淋巴结转移的宫颈癌组织中比较,差异均有统计学意义(P<0.05),而在不同年龄、不同病理类型及组织学分级的宫颈癌组织中差异无统计学意义(P>0.05)。HuR蛋白阴性患者的5年累积生存率均高于HuR蛋白阳性患者,差异有统计学意义(P<0.05)。101例宫颈癌组织中COX-2蛋白的阳性表达率为59.40%(60/101),COX-2蛋白的阳性表达率在不同的临床分期、组织学分级、淋巴结转移及不同病理类型的宫颈癌组织比较,差异有统计学意义(P<0.05),但在不同年龄、不同癌灶大小的宫颈癌组织比较差异无统计学意义(P>0.05)。COX-2蛋白阴性患者的5年累积生存率高于COX-2蛋白阳性患者,差异有统计学意义(P<0.05)。HuR蛋白的表达与COX-2蛋白的表达呈正相关(r=0.383,P=0.000)。结论宫颈癌手术预后与HuR蛋白、COX-2蛋白阳性有关,HuR蛋白和COX-2蛋白可作为宫颈癌患者预测预后的指标之一。

RNA结合蛋白HuR对NF-κB抑制因子α转录后调控机制的初步研究

目的:探讨RNA结合蛋白HuR对NF-κB抑制因子α(IκB-α)转录后调控机制。方法:构建IκB-αmRNA 3'UTR报告基因真核表达质粒,并转染3T3细胞;体外生物素标记IκB-αmRNA 3'UTR并进行RNA pull-down;过表达及干扰HuR后,qPCR检测其对IκB-αmRNA稳定性的影响,Western bltting检测其对IκB-α蛋白表达的影响。结果:(1)IκB-αmRNA 3'UTR报告基因真核表达质粒构建成功;(2)报告基因检测:共转染pcDNA3-HA-HuR质粒及IκB-αmRNA 3'UTR报告基因质粒后与对照组相比其数值明显增高;(3)用生物素标记的IκB-αmRNA3'UTR探针进行RNA pull-down,可以检测到特异性结合的HuR蛋白;(4)过表达HuR,IκB-αmRNA稳定性无明显变化,蛋白表达明显上调;干扰HuR表达后,IκB-αmRNA稳定性无明显变化,蛋白表达明显下调。结论:(1)HuR可以与IκB-αmRNA 3'UTR特异性结合并参与调节IκB-αmRNA 3'UTR的功能;(2)HuR对IκB-αmRNA稳定性无明显影响,其主要调控IκB-α蛋白表达,使其表达上调。

MiR-519通过调节HuR表达抑制胃癌细胞活力

目的:探讨mi R-519参与调节胃癌细胞活力的机制。方法:q PCR检测胃癌细胞中mi R-519表达,Western印迹法检测胃癌细胞中Hu R蛋白表达,M法研究肿瘤细胞的活力,脂质体转染法分别转染Hu R真核表达质粒及干扰片段、转染mi R-519。结果:胃癌细胞株中Hu R蛋白表达高于对照组细胞,过表达Hu R可增加细胞活力(P<0.001),干扰Hu R表达后,细胞活力降低(P=0.001);胃癌组织中mi R-519表达低于对照组(P=0.001),过表达mi R-519可抑制Hu R蛋白表达并降低胃癌细胞活力。结论:Mi R-519可能通过下调Hu R蛋白表达而降低胃癌细胞活力。

RNA结合蛋白HuR在肿瘤耐药及药物敏感性中的作用

人抗原R(human antigen R,HuR)属于果蝇胚胎致死异常视觉(embryonic lethal abnormal vision,ELAV)家族的RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP),1996年克隆成功,随后发现其在神经发育和细胞分化中具有重要作用。近年发现,HuR通过增强肿瘤相关RNA的稳定性而参与了肿瘤发生、发展、转移和血管生成,具有类似原癌基因的功能;但也有研究显示HuR具有双重作用,既能促进肿瘤细胞对化疗药物多柔比星、吉西他滨的敏感性,又与肿瘤细胞对顺铂、紫杉醇类药物耐药相关。本文结合笔者所在课题组前期对HuR的研究基础,就HuR在肿瘤多药耐药及药物敏感性中的作用简要作一综述。

RNA结合蛋白HuR在肿瘤中的作用

RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)是近年来发现的具有多种生物学作用的分子家族,其中,HuR属于胚胎致死异常视觉家族的RBPs,表达广泛。最初发现HuR与神经分化相关,通过与靶mRNA3'UTR的ARE结合,在转录后水平调控RNA的稳定性和蛋白表达。近年发现,HuR与细胞增殖、肿瘤相关的炎症和血管生成密切相关,提示HuR可能参与了肿瘤发生、发展和转移过程。因此,以HuR为靶点的抗肿瘤策略可能为将来的肿瘤治疗带来希望。

线粒体基于HUR/PIM1信号通路在高血压血管内皮细胞损伤中的机制

目的基于HUR/PIM1信号通路探讨线粒体在高血压血管内皮细胞损伤中的机制。方法AngⅡ处理人脐血管内皮细胞(HUVCE)分为3组:control组、AngⅡ组和Mdivi-1组。CCK-8、流式细胞术和transwell检测细胞活力、凋亡及迁移率。线粒体选择性探针检测线粒体形态,JC-1染料测量线粒体膜电位。qPCR和Western blot检测细胞中Drp-1、ROS、HUR/PIM1 mRNA和蛋白含量,体外血管形成验证血管生成。结果与control组比较,AngⅡ组细胞活力降低、Drp-1和ROS蛋白表达升高和线粒体形态改变及膜电位降低,HUR/PIM1信号通路mRNA和蛋白含量升高,血管生成增加,Mdivi-1组效果相反。结论Mdivi-1降低线粒体的表达和AngⅡ诱导的细胞的HUR/PIM1通路的表达,可抑制AngⅡ诱导的细胞的凋亡、迁移及血管生成。

ARHI基因与HuR蛋白在胰腺癌PANC-1细胞中的表达

目的观察ARHI基因转染胰腺癌PANC-1细胞后对HuR蛋白的影响。方法采用脂质体法将表达ARHI基因的质粒p LNCX2-ARHI-EGFP和空载体p LNCX2-EGFP转染胰腺癌PANC-1细胞,细胞分为3组:实验组(p LNCX2-ARHIEGFP)、空载体转染组(p LNCX2-EGFP)和PANC-1细胞空白对照组,用G418筛选稳定转染的细胞株;采用PCR和Western blot方法检测ARHI基因表达,采用Western blot方法检测HuR蛋白表达。结果稳定转染ARHI基因组可检测到ARHI基因mRNA和蛋白的表达。根据图像灰度计算蛋白条带相对表达量,稳定转染ARHI基因组HuR蛋白表达(0.2226±0.0644)较空载体对照转染组(0.4063±0.0925,P=0.029)和PANC-1细胞空白对照组(0.4178±0.1319,P=0.022)显著降低。结论 ARHI基因可以导致胰腺癌细胞株中HuR蛋白表达降低。

HuR基因的慢病毒干扰载体构建及其病毒包装

目的构建人HuR基因慢病毒干扰载体和基因敲低细胞株,为揭示C/EBPβ3’UTR RNA与HuR蛋白相互作用抑制肝癌细胞增殖的分子机制奠定基础。方法根据shRNA设计原则设计人HuR基因的shRNA序列,用化学合成法合成shDNA序列,以LV10(pGLVU6/RFP/Puro)为载体骨架,构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,并与慢病毒包装辅助载体(pLP1、pLP2和pLP/VSVG)共转染HEK293T细胞,收集病毒液纯化后感染SMMC-7721细胞并用嘌呤霉素杀死未感染的肝癌细胞,荧光显微镜下挑取单克隆红色荧光细胞集落,扩大培养后通过Western blot验证肝癌细胞内源性HuR蛋白表达。结果经DNA测序鉴定,LV10-HuR正是所需的慢病毒干扰载体。通过共转染获得的重组慢病毒颗粒感染的肝癌细胞在荧光显微镜下显示红色荧光。嘌呤霉素筛选和单克隆细胞集落挑取获得显示红色荧光细胞株,western blot证明稳转细胞内源性HuR基因表达下降,证明LV10-HuR慢病毒干扰载体可以抑制肝癌细胞内源性HuR基因表达。结论成功构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,包装出有活性的重组慢病毒颗粒,建立HuR基因敲低肝癌细胞株。

HuR与肿瘤发生发展及预后关系的研究进展

HuR蛋白是mRNA结合蛋白之一,可与多种肿瘤调控因子的mRNAs相连接,调节其稳定性和翻译过程。近年来研究发现HuR与多种恶性肿瘤的发生过程密切相关,现就HuR与肿瘤发生发展及预后关系的研究进展加以综述。

HuR蛋白在胸腺瘤组织中的表达及意义

目的:检测HuR蛋白在胸腺瘤组织中的表达,分析其与胸腺瘤是否发生侵袭邻近器官及组织学分型的关系及意义。方法:采用免疫组织化学方法检测HuR在50例胸腺瘤组织中的表达。结果:HuR的表达与胸腺瘤是否发生侵袭相关(P<0.05),无侵袭及有侵袭阳性率分别为40.91%及78.57%。HuR的表达与胸腺瘤的组织学分型相关(P<0.05)。结论:HuR在胸腺瘤细胞核中高表达可能参与了胸腺瘤的发生发展过程,有望影响胸腺瘤的术后治疗。

HuR和p120在结直肠癌中的表达及意义

目的检测HuR和p120在结直肠癌组织中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学方法（IHC）检测HuR和p120在454例结直肠癌组织中的表达。结果结直肠癌组织中HuR表达高于正常结直肠组织（P〈0．05），而p120表达则低于正常结直肠组织（P〈O．05）。45例结直肠癌组织中，HuR、p120阳性表达率均与肿瘤的组织学分级、浸润程度及临床TNM分期有关（P〈0．05）；而与年龄、性别、肿块大小无关（P均〉0．05）；P120在有、无淋巴结转移组中表达差异有统计学意义（P〈0．05），HuR蛋白表达差异无统计学意义（P〉0．05）；HuR和p120表达呈负相关（r=-0．343，P〈0．05）。结论结直肠癌中HuR高表达可能参与了肿瘤发生与增殖，而p1204R,表达可能与肿瘤浸润及淋巴结转移有关。

喉癌组织中HuR基因和survivin基因的表达及临床意义

目的探讨HuR基因和survivin基因在喉癌组织中的表达及临床意义。方法采用免疫组化法对42例喉癌组织及36例正常的切缘喉黏膜组织中HuR基因和survivin基因的表达进行检测,分析两者的表达与临床病理参数的关系,以及两者之间的相关性。结果 HuR基因和survivin基因在喉癌组织中的阳性表达率均高于正常的切缘喉黏膜组织(<0.05);HuR基因和survivin基因的表达均与淋巴结转移无相关性(=0.024、0.057,>0.05),而均与T分期和临床分期有相关性(=0.339、0.375、0.294、0.302,<0.05)。此外HuR基因的表达还与喉癌细胞的病理分化程度有关(=0.323,<0.05)。喉癌组织中HuR基因与sur-vivin基因表达呈正相关(=0.526)。结论喉癌中HuR基因和survivin基因两者的表达均增高,两者的表达产物呈正相关。HuR基因的表达产物可能通过对survivin基因的表达进行调控促进喉癌的发生与发展。

HuR蛋白在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达及其意义

目的探讨人抗原R(human antigen R,HuR)在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达及其临床意义。方法利用免疫组化法和图像分析技术检测10例正常卵巢组织,20例卵巢浆液性瘤,32例卵巢浆液性癌中HuR蛋白的表达。结果正常卵巢组织、卵巢浆液性肿瘤组织中均有HuR蛋白表达,HuR蛋白在卵巢癌中的表达较卵巢瘤及正常组织中增强,两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。有淋巴结转移的卵巢浆液性癌中HuR蛋白表达高于无淋巴结转移(P<0.05)。结论卵巢浆液性肿瘤的发生发展与HuR的过表达密切相关。

SND1蛋白与HuR蛋白相互结合作用

人源SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）蛋白由N端的SN（staphylococcal nucleases）结构域和C端的TSN（Tudor-SN5）结构域组成,其中SN结构域又包含SN1~SN4四个重复的功能片段.本课题组前期研究结果表明,SND1蛋白可以通过SN结构域与G3BP（Ras-GAP SH3 domain-binding protein）蛋白相互结合,共同参与细胞应激颗粒（stress granules,SGs）的形成.SGs是真核细胞在受到氧化应激、病毒感染等外界刺激时在胞浆内形成的与RNA代谢相关的颗粒状结构.对于SGs的成分鉴定及相互作用的分析一直是学者们研究的热点.本研究中,免疫共沉淀实验结果表明,以抗SND1抗体可以共沉淀出HeLa细胞内另一个重要的应激相关人类抗原R（human antigen R,HuR）蛋白.另外,利用脂质体转染法将pcDNA3-FLAG-HuR重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,成功过表达外源性的FLAG-HuR融合蛋白,再以抗FLAG标签抗体又可以反向共沉淀出内源性SND1蛋白,证明SND1与HuR之间存在蛋白质间的相互结合作用.细胞免疫荧光实验结果表明,当给予HeLa细胞0.5 mmol/L亚砷酸钠氧化应激时,SND1与HuR蛋白共同定位于胞浆中的SGs结构中.GST-pulldown实验结果进一步表明截短的SN结构域可以结合HuR蛋白,其中以SN1功能片段的结合能力最强,表明SND1蛋白是通过SN结构域与HuR蛋白形成应激复合物,参与SGs的胞浆组装.并不定位于SGs的TSN结构域亦可结合HuR蛋白,提示SND1-HuR的蛋白相互作用可能并不局限于SGs,具有其它方面的功能意义.

小鼠HuR真核表达载体构建及对Lewis肺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的构建小鼠同源的人抗原R(HuR)基因真核表达载体,观察HuR过表达对Lewis肺癌(LLC)细胞增殖和侵袭的影响。方法从LLC细胞中抽提总RNA,RT-PCR扩增HuR cDNA,基因工程方法将PCR片断克隆至真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点。重组质粒经EcoRI和SmaI双酶切鉴定和测序后,使用LipofectamineTM2000转染LLC细胞。Western blot-ting检测HuR在细胞中的表达。MTT和Transwell系统分别检测细胞增殖和侵袭能力。结果经酶切、测序鉴定,小鼠HuR基因正确插入到pEGFP-N1的多克隆位点,获得pEGFP-HuR;Western blotting显示转染组与未转染组比较,HuR蛋白表达、LLC细胞增殖能力和侵袭能力均显著增强。结论HuR过表达可提高肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。

胚胎致死性异常视觉蛋白HuR在卵巢上皮性癌表达及预后

目的探讨HuR在卵巢上皮性癌表达与临床意义。方法采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法对68例原发卵巢上皮性癌组织,10例交界性卵巢肿瘤,5例正常卵巢组织中的HuR表达进行检测,判断HuR在卵巢上皮性癌表达的意义。结果 (1)HuR在卵巢上皮性癌胞核中表达明显高于交界性卵巢肿瘤和正常卵巢组织(P<0.05)。(2)胞质HuR在恶性卵巢肿瘤组织与交界性卵巢肿瘤的表达明显高于正常卵巢组织(P<0.05)。(3)胞质HuR的表达与卵巢上皮性癌组织学类型、淋巴结转移和年龄无关(P>0.05),与组织学分级和临床期别有关(P<0.05)。组织分化高的卵巢上皮性癌胞质HuR的表达较中-低分化组的表达弱(P<0.05)。胞质HuR的表达在中分化与低分化之间差异无统计学意义(P>0.05);临床分期中Ⅲ～Ⅳ期胞质HuR的表达显著高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)。结论 HuR在卵巢上皮性癌的表达明显增高,提示HuR可能与卵巢癌的发生发展密切相关。