phVEGF_(165)原位转染缺血肌肉后hVEGF及其蛋白的表达

目的探讨慢性下肢动脉缺血的基因治疗。 方法选用血管内皮生长因子 (VEGF)作为治疗基因 ,通过建立实验兔慢性下肢动脉缺血模型 ,将构建的人VEGF1 6 5cDNA真核表达载体phVEGF1 6 5注入缺血肌肉内 ,采用RT -PCR和原位杂交法测定肌肉内hVEGF1 6 5基因表达 ,采用免疫组化和Western印迹法测定其蛋白产物的表达。 结果骨骼肌细胞外源性hVEGF1 6 5基因表达量于注射后 1周达到高峰 ,持续 2 ～3周。蛋白表达于注射后 2周达到高峰 ,维持至注射后 4周。 结论骨骼肌细胞能摄取并表达外源性hVEGF1 6 5基因 ,并能进一步合成分泌hVEGF1 6 5蛋白。phVEGF1 6 5肌肉直接注射的作用时间有限、范围局限 。

hVEGF基因防治血管成形术后再狭窄

目的 :观察人血管内皮生长因子 (h VEGF)基因对血管成形术后再狭窄的防治作用。 方法 :建立兔颈总动脉球囊损伤模型 ,以先期构建的真核表达质粒 pc DNA3/ h V EGF1 6 5 (5 0 0 μg,n=12 )和真核载体 pc DN A3(5 0 0 μg,n=12 )分别于血管腔内给药 ,给药后 2周、4周先行颈总动脉造影 ,再取材分别行 H- E、VB染色及 Northern blot分析。结果 :给药后 2周、4周颈总动脉造影示治疗组直径狭窄较对照组明显减少 ;病理检测示 2周、4周治疗组管腔狭窄率较对照组显著减轻 [(9.5 8± 1.35 ) % vs(31.72± 1.72 ) % ;(18.0 9± 2 .93) % vs (44 .0 5± 3.2 8) % ,P<0 .0 1];Northern blot分析显示 2周、4周治疗组特异性条带显色较对照组明显增强。 结论 :pc DNA3/ h VEGF1 6 5 裸质粒 DNA血管腔内给药能转染平滑肌细胞并持续表达至少 4周 ,促进了内皮细胞再生 ,减轻了血管成形术后再狭窄程度。

缺氧、复氧条件下低氧反应元件(HRE)对心肌细胞转染hVEGF_(165)基因表达的调控作用

目的:探讨缺氧、复氧条件下,低氧反应元件(HRE)作为氧条件基因表达控制开关,对心肌细胞转染rAAV-HRE9-hVEGF165基因表达的调控作用。方法:分离新生SD大鼠心肌细胞,采用无血清培养,将在HEK293T细胞进行包装后获得的腺相关病毒转染培养的心肌细胞。实验共分为8组:Ⅰ组(空白对照组):常氧培养24h(氧浓度21%);Ⅱ组(缺氧对照组):常氧培养16h,缺氧8h(氧浓度1%);Ⅲ组(转基因对照组):常氧培养24h;Ⅳ组(转基因缺氧1组):转基因后缺氧8h;Ⅴ组(复氧1组):常氧培养16h,缺氧8h、复氧4h;Ⅵ组(复氧2组):常氧培养16h,缺氧8h、复氧8h;Ⅶ组(复氧3组):常氧培养16h,缺氧8h、复氧12h;Ⅷ组(转基因缺氧2组):转基因后常氧培养16h,缺氧20h。ELISA法测定培养液VEGF蛋白含量;细胞免疫荧光染色及RT-PCR分别检测细胞内VEGF蛋白及VEGF165mRNA的表达。结果:95%的培养心肌细胞可见自律搏动,cTn-I染色阳性率为86%;病毒转染率约为87%。Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ组培养液中VEGF蛋白含量显著高于其它各组(P<0·01),细胞免疫荧光VEGF蛋白染色呈阳性;RT-PCR测定显示,Ⅳ、Ⅴ及Ⅷ组可见484bp目的条带。结论:rAAV-HRE9-hVEGF165可成功地转染原代培养心肌细胞,在缺氧环境下,受HRE的调控,VEGF165mRNA及VEGF165蛋白可有效表达,而在常氧状态下,目的基因的表达及蛋白合成即行中止。

hVEGF基因工程生物膜覆盖大鼠全层皮肤缺损创面的模型建立

目的建立含人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)重组质粒的成纤维细胞种植的基因工程生物膜覆盖大鼠全层皮肤缺损创面的动物模型。方法在SD大鼠背部皮肤制作深达皮肤全层的正方形创面,实验组SD大鼠创面上覆含hVEGF重组质粒的成纤维细胞种植的基因工程生物膜,对照组包括3组,分别在大鼠创面上覆整合空质粒的成纤维细胞的生物膜、空白生物膜和仅覆切口膜。采用形态学方法,观察术后3、7、14、29 d实验组和对照组大鼠创面肉芽组织生长及创面愈合情况。结果在各时相实验组大鼠创面中成纤维细胞增生数及新生的毛细血管数均高于对照组大鼠。结论将含hVEGF重组质粒的成纤维细胞种植的基因工程生物膜覆盖于大鼠全层皮肤缺损创面,能诱导血管生成,强有力地促进肉芽组织形成。

hVEGF_(165)和嵌合水蛭肽融合基因的真核表达载体的构建及其表达

目的:克隆hVEGF165和嵌合水蛭肽(fused hirudin,FH)融合基因,构建hVEGF165-FH/pcDNA3.0基因表达载体,并在人内皮细胞株中表达。方法:分别通过PCR法扩增hVEGF165和引物退火法合成FH基因,将融合基因插入表达载体pcD-NA3.0,构建重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0。对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析,将正确克隆的质粒分别作体外快速转录翻译鉴定,以及经脂质体介导转染人内皮细胞株,并对表达产物进行鉴定。结果:hVEGF165和FH成功融合,形成711 bp的目的片段,并成功构建重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0,重组质粒转染人内皮细胞株有hVEGF165-FH表达。结论:重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0在人内皮细胞株中得到表达,为其融合蛋白活性研究及基因治疗打下良好基础。

加味丹参饮含药血清对hVEGF165转染BMSCs促IRI大鼠心肌血管新生的影响

目的探讨加味丹参饮含药血清诱导血管内皮生长因子165(hVEGF165)转染后BMSCs移植IRI大鼠的心肌血管新生的影响。方法构建hVEGF165转染BMSCs,将hVEGF165转染后PⅢ/Ⅳ BMSCs分别加入加味丹参饮含药血清和空白血清,体外诱导48 h。建立IRI大鼠模型,将实验大鼠分为4组,A组:假手术组;B组:IRI组;C组:hVEGF165转染组;D组:hVEGF165转染+加味丹参饮含药血清组。移植第7天,HE染色观察心肌组织形态学变化并做微血管计数。结果移植7 d后,与A组相比,B组心肌微血管有一定再生,C组及D组与B组相比,微血管数上升明显,差异具有统计学意义(P<0.05);D组与C组相比,微血管数上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 IRI大鼠模型在移植hVEGF165转染BMSCs后,新生血管增多,加味丹参饮含药血清和hVEGF165转染联合应用效果更佳。

hBcl-2和hVEGF_(165)双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础。方法通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF165基因片段,并克隆到pMD-19T载体。将目的基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF165依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上。线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒。重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化。通过荧光计数确定病毒感染滴度。结果克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF165基因的PCR产物,滴度测定为5×109pfu/mL。结论成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础。

hBcl-2和hVEGF_(165)双基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的将hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测目的基因的表达及表达产物的生物学效应。方法贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞;重组腺病毒转染BMSCs,用PCR法验证目的基因mRNA在间充质干细胞中的表达;用ELISA及Western Blot检测双基因在转染后细胞的蛋白表达量;用MTT法及Annexin V-PE/7-AAD法分别观察对转染后BMSCs增殖及凋亡的影响。结果大鼠BMSCs分离纯化成功。在mRNA水平,转染后的BMSCs可表达这两个外源基因;转染后细胞培养上清液hVEGF165峰浓度达到(924.3±56.5)pg/mL,多个时间点与对照组相比,浓度差异有统计学意义(P<0.05);Western Blot也检测到转染后细胞Bcl-2蛋白表达量明显比对照组增加(P<0.05)。MTT比色法观察到,转染细胞分泌的hVEGF165上清液可促进BMSCs的增殖(P<0.05);用Annexin V-PE/7-AAD检测转染后间充质干细胞的凋亡率下降,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论转染重组腺病毒载体的BMSCs能够表达hBcl-2及hVEGF165,并且表达产物具有生物学效应。

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的构建编码hVEGF165mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法以hVEGF165mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果。结果构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功。靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显。结论成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒。

复制缺陷型腺病毒载体介导hVEGF cDNA在C2C12和NIH3T3细胞中的表达

为提高hVEGFcDNA在心肌中的表达 ,降低在其它组织中表达可能产生的不良反应 ,用PCR法得到人磷酸肌酸激酶 (MCK)增强子和CMV核心启动子 .利用克隆技术构建了含双拷贝MCK增强子 (m)和人巨细胞病毒 (CMV)核心启动子 (c)的嵌合启动子 (mmc) ,构建真核表达质粒pK3 mmcLacZ ,制备受mmc嵌合启动子调控的重组腺病毒Ad mmcVEGF .经X gal染色、β 半乳糖苷酶定量分析、RT PCR、hVEGFELISA定量分析、VEGF活性测定等研究表明 。

hVEGF基因修饰的SD大鼠BMSCs与胶原膜BME-10X复合物的成骨能力研究

目的观察人血管内皮生长因子(hVEGF_(165))基因的骨髓基质细胞(BMSCs)与胶原膜BME-10X复合的相容性及该复合物移植在体内的成骨情况,为其能否修复牙周骨质缺损提供依据。方法在体外将hVEGF_(165)基因转染的SD大鼠BMSCs种植于胶原膜BME-10X复合膜上,使用激光共聚焦扫描显微镜、荧光显微镜、扫描电镜及组织学方法进行观察,并将该复合物植入裸鼠皮下,于4、8周处死裸鼠取材制成组织切片,H-E染色后观察异位体内成骨和血管生成的情况。结果复合物培养24h后见目的细胞在胶原膜中贴附、伸展,各层BME-10X胶原膜上均有数量不等的细胞附着。转染细胞在胶原膜表面复层生长,并进入内部间隙中。复合物植入裸鼠皮下后,可见新生胶原纤维、类骨质样结构和新生血管的形成。结论hVEGF_(165)基因转染BMSCs在胶原膜BME-10X上生长良好,细胞-胶原复合物在裸鼠体内具有异位成骨及促进新生血管形成能力。

携hVEGF165表达载体阳离子脂质微泡的制备

目的制备携hVEGF165表达载体阳离子脂质微泡并测定其与hVEGF165表达载体的结合率。方法制备携hVEGF165表达载体阳离子脂质微泡,测定其粒径大小、浓度、Zeta电位;测定与hVEGF165表达载体的结合率。结果阳离子脂质微泡90%粒径范围:1μm-3μm,平均粒径:(1.31±0.23)μm,平均浓度:(3.17±0.16)×108/mL,Zeta电位:(28.00±1.84)mV,与hVEGF165表达载体的最大结合率:(35.34±0.71)%。结论采用机械振荡法制备的阳离子脂质微泡,粒径分布良好,浓度、Zeta电位稳定,与hVEGF165表达载体结合率较高,是携带基因表达的良好载体系统。

腺病毒介导hVEGF编码基因转染骨髓基质干细胞的实验研究

目的应用携带hVEGF基因的重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),观察hVEGF的表达情况。方法体外培养大鼠骨髓基质干细胞,含hVEGF基因的重组腺病毒转染骨髓基质干细胞,转染后在荧光显微镜下观察并采用ELISA法检测hVEGF的表达水平。结果 rAd-hVEGF转染骨髓基质干细胞后,ELISA检测发现转染组上清液中hVEGF蛋白分泌量明显高于对照组(P<0.01)。结论 rAd-hVEGF转染大鼠骨髓基质干细胞能够表达并分泌hVEGF,为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供可行性研究。

重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP的构建与鉴定

目的人血管内皮生长因子(的hVEGF165)为靶基因,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因构建体的复制缺陷型腺病毒载体,为基因治疗牙周进一步再生奠定了基础。方法质粒的pDC316-的VEGF165为模板,PCR扩增基因片段进行消化,获得的hVEGF165用于连接到含有绿色荧光蛋白标记基因重组质粒的消化方法的pDC316-MCMV-EGFP质粒载体,PCR鉴定和双酶切证实成功构建重组质粒;使用ADMAX包装系统,改造的质粒共转染用质粒骨架293包装细胞系和重组病毒的扩增;扩增病毒的离子交换纯化;TCID50测定病毒粒子和效价的数目;的荧光的荧光显微镜重组腺病毒表达。结果 PCR鉴定,酶切分析和测序证实成功构建人VEGF基因的携带绿色荧光蛋白标记(的hVEGF165)重组质粒的pDC316-的hVEGF165-MCMV-EGFP和同源重组腺病毒Ad5的-的hVEGF165-EGFP的成功。扩增和纯化后,腺病毒颗粒的数量测量5.4×1011VP/mL,约2.0,为1.8×1010CCID50/mL的滴度OD260/OD280值。结论成功构建携带hVEGF165基因重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP并获得高滴度病毒颗粒,为hVEGF165基因功能研究以及细胞移植、基因治疗提供有效的工具。

hVEGF_(165)及hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体体内诱导成骨及成血管研究

目的探讨hVEGF165及hBMP-7共表达重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)体内诱导成骨及成血管的活性,为股骨头缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head,ANFH)的AAV基因治疗提供理论基础。方法取体外培养的第3代兔BMSCs,分别采用以下4种病毒转染并分为4组:rAAV-hVEGF165-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-hBMP-7(A组)、rAAV-hVEGF165-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)(B组)、rAAV-hBMP-7-GFP(C组)及rAAV-IRES-GFP(D组)。取24只雄性新西兰大耳白兔制作后肢缺血模型,并随机分为4组(n=6),于股骨肌肉内植入上述4组病毒转染的BMSCs,8周后应用超声影像学检测兔后肢胫前动脉血流量,行CD34免疫组织化学染色检测微血管生成。另取24只雄性新西兰大耳白兔制作股骨肌袋模型,并随机分为4组(n=6),于肌袋内植入上述4组病毒转染的BMSCs,8周后应用X线片检测兔后肢原位骨化,行von Kossa钙盐染色检测肌肉组织成骨矿化。结果病毒注射后动物未出现局部或全身毒性反应。病毒注射后8周,A组兔后肢胫前动脉血流百分比及CD34阳性微血管数均高于其他3组,差异有统计学意义(P<0.05);B组高于C、D组,差异有统计学意义(P<0.05);C、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。病毒注射后8周,A、C组兔后肢肌袋内出现可被X线检测到的原位骨化,von Kossa肌肉组织钙盐染色可见大量钙盐沉积,且A组原位骨化及钙盐沉积程度均较C组强;B组及D组均未见明显原位骨化及钙盐沉积形成。结论 rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7载体具有体内诱导成骨及成血管的生物学活性。

hVEGF_(165)及hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体介导基因表达的时效性研究

目的探讨hVEGF165及hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associated virus,rAAV)介导基因表达的时效性,为体内应用其进行骨坏死的基因治疗奠定理论基础。方法应用荧光细胞计数法测定rAAV转染兔BMSCs的最佳转染复数。分别采用rAAV-hVEGF165-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-hBMP-7(实验组)、绿色荧光蛋白(green?uorescent protein,GFP)标记平行对照rAAV-IRES-GFP(对照组)在最佳转染复数条件下转染体外培养的第3代兔BMSCs。于不同时间点分别行GFP表达检测、RT-PCR检测、Western blot检测明确rAAV体外介导基因表达的时效性关系。将实验组及对照组病毒转染后的BMSCs以5×106个/mL密度,分别注射至9只2月龄纯种雄性新西兰大耳白兔制备的肌袋模型内各1mL(实验组1及对照组1),于不同时间点分别行GFP表达检测、Western blot检测及ELISA检测明确rAAV体内介导基因表达的时效性关系。结果 rAAV转染兔BMSCs的最佳转染复数为5×104v.g/cell。通过体外检测显示rAAV转染BMSCs后1d即有目的基因表达,14d时表达强度明显增强,至28d时仍维持较强表达。通过体内检测显示体内转染2周可检测到目的基因表达,6周时表达强度增强,8周时仍维持较高水平。ELISA法检测实验组1细胞培养上清中hVEGF165和hBMP-7含量分别为(248.67±75.58)pg/mL和(4.80±0.61)ng/mL,对照组1分别为(32.28±8.42)pg/mL和(0.64±0.42)ng/mL,两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论双基因共表达rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7具有较好的转染时效性。

hVEGF_(165)基因转染大鼠BMSCs的实验研究

目的构建携带hVEGF165基因的重组腺病毒载体pAdxsi-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)-hVEGF165,体外转染大鼠BMSCs,观察转染后hVEGF165的表达情况以及对BMSCs生长增殖的影响,为进行血管再生的基因治疗奠定实验基础。方法将hVEGF165从原始质粒切下连接到pShuttle-巨细胞病毒-EGFP重组穿梭载体,并转移至pAdxsi载体上,获得重组腺病毒载体质粒pAdxsi-EGFP-hVEGF165,进行酶切鉴定及基因测序。采用PacI限制性内切酶线性化pAdxsi-EGFP-hVEGF165,并转染人胚肾细胞HEK293,收获重组腺病毒,测定病毒滴度。贴壁法培养Wistar大鼠BMSCs,体外转染携带EGFP基因的重组腺病毒(pAdxsi-EGFP),荧光倒置相差显微镜及流式细胞术确定最佳病毒感染复数(multiplicities of infection,MOI)。依据最佳MOI转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165至BMSCs,采用Western blot、RT-PCR及ELISA法检测转染后hVEGF165的表达;MTT法评价转染后BMSCs生长增殖情况。结果酶切鉴定及基因测序提示重组腺病毒载体质粒含有hVEGF165 cDNA;经多轮感染、扩增后,病毒滴度可达1×1010 pfu/mL。荧光倒置相差显微镜观察转染pAdxsi-EGFP后MOI为150 pfu/cell时转染效果最佳,流式细胞仪检测转染效率约88%。Western blot和RT-PCR检测示,pAdxsi-EGFP-hVEGF165转染BMSCs 48 h后在蛋白质和基因水平均可有效表达hVEGF165;ELISA检测示其含量在7 d达高峰,在20 d时仍有表达,1、3、5、7、9、11、13、15、20 d各时间点hVEGF165含量均显著高于EGFP基因转染组及未转染组(P<0.05)。MTT结果显示,各时间点转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165的BMSCs与未转染组细胞的吸光度(A)值比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMSCs是一种较理想的基因载体细胞,成功制备的重组腺病毒载体质粒可在MOI值为150时将hVEGF165基因有效转染至BMSCs;转染后hVEGF165表达水平较高、持续时间较长,且对BMSCs的生长增殖无明显影响。

hVEGF_(165)及hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体的体外生物学活性研究

目的通过体外实验探讨hVEGF165和hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associated virus,rAAV)体外生物学活性,为体内应用其进行骨坏死的基因治疗奠定理论基础。方法分别采用rAAV-hVEGF165-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-hBMP-7(实验组)、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的rAAV-IRES-GFP(对照组)转染体外培养的第3代兔BMSCs,于转染后1、2、3、7及14d应用ELISA法及转染后14d应用Western blot法鉴定两组hVEGF165和hBMP-7表达;转染后14d行细胞免疫荧光染色观察hVEGF165和hBMP-7表达一致性。应用第3代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)管状血管形成实验检测hVEGF165蛋白活性。取第3代BMSCs行诱导成骨实验,Gomori钙钴法ALP染色及茜素红法钙盐染色检测hBMP-7蛋白活性。结果ELISA检测示随转染时间延长,两组hVEGF165和hBMP-7表达逐渐升高;实验组各时间点hVEGF165和hBMP-7表达量均明显高于对照组(P<0.05)。Western blot检测示实验组可见hVEGF165和hBMP-7表达,对照组未见阳性表达。细胞免疫荧光染色观察示实验组hVEGF165和hBMP-7染色呈阳性,表达部位和强度具有较好一致性;对照组未见阳性表达。HUVEC管状血管形成实验示实验组HUVEC拉长变形、出芽且相互交联成管状样结构;与对照组相比,管状血管数比较差异有统计学意义(P<0.05)。ALP染色见实验组细胞出现深染颗粒,对照组细胞内浅着色;与对照组相比,矿化结节数比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论双基因共表达rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7体外具有良好的生物学活性。

hVEGF_(121)与βhCG融合蛋白的克隆、分离纯化与初步鉴定

构建一种新型抗肿瘤融合蛋白疫苗,包含hVEGF121和βhCG抗原表位,并探索融合蛋白的纯化条件和方法。采用PCR方法,克隆VEGF和βhCG基因,并通过限制性内切酶NcoⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ将两个基因逐个插入pET-28a(+)质粒中,利用质粒自带的卡那霉素抗性筛选出阳性克隆,获得重组基因的表达载体。对重组菌进行乳糖诱导表达后,通过超声破碎,硫酸铵分级沉淀,阴离子交换层析等方法进行融合蛋白的分离纯化,Western-blot鉴定。测序结果表明成功构建重组载体pET-28a-VEGF-M2-X10-βhCG-CTP37,重组基因长993 bp,编码331个氨基酸残基。SDS-PAGE显示,经乳糖诱导,Escherichia coli BL21(DE3)重组菌表达hVEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37多肽,约占菌体总蛋白量的35%。融合蛋白经分离纯化后纯度可达到电泳纯,约占蛋白冻干粉的80%。结论:克隆、测定了融合蛋白基因,并在Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达hVEGF121-M2-X10-βhCG多肽,同时成功分离纯化此多肽。