虎纹捕鸟蛛Kunitz型毒素基因的分子改造和表达

目的构建HW11c40突变体,寻找合适的表达系统表达HW11c40突变体和HWTX-XI(虎纹捕鸟蛛毒素-XI),解决HWTX-XI来源问题和HW11c40改造后毒素难于获取的难题,为合适HW11c40突变体的筛选和治疗急性胰腺炎高效新药的研制奠定基础。方法用PCR定点突变的方法突变HW11c40相关氨基酸残基,构建HW11c40突变体。HW11c40突变体和HWTX-XI基因经PCR扩增后插入到pET-40b(+)载体,基因5'端插入肠激酶切割位点,再重组到大肠埃希菌BL21(DE3)进行原核周质表达,获得相应的融合蛋白并进行SDS-PAGE鉴定,用镍柱纯化融合蛋白。融合蛋白用肠激酶酶切,释放出的目的蛋白用Tricine-SDS-PAGE进行鉴定,用镍柱分离目的蛋白,进行高效液相色谱进行进一步分离纯化后作质谱鉴定。对HW11c40突变体和HWTX-XI的表达时间、温度和IPTG浓度进行优化。结果成功获得HW11c40的4个突变体,并正确构建HW11c40突变体和HWTX-XI的原核表达载体。经SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE鉴定,重组质粒转化菌在无IPTG诱导的情况下成功表达所有HW11c40突变体和HWTX-XI的融合蛋白,经肠激酶酶切均获得对应的目的蛋白,其中HWTX-XI表达量为3.4mg/L。结论成功构建出HW11c40突变体和HWTX-XI的重组质粒并在原核细胞内高效表达出相应的目的蛋白,开辟了基因工程表达HWTX-XI的新途径,同时解决了HW11c40改造后毒素获取难题,突破了整个系列研究的瓶颈,为突变体的筛选及治疗急性胰腺炎高效新药的研制奠定了基础。