红肉火龙果HpHXK基因克隆、表达及酶学特性分析

【目的】分析红肉火龙果催化己糖磷酸化糖酵解途径关键酶—己糖激酶(Hexokinase,HXK)基因的克隆、表达及酶学特性,为研究HXK基因在果实可溶性糖积累过程中的作用机制及提高红肉火龙果果实品质提供理论依据。【方法】以红肉火龙果紫红龙的成熟茎组织及花后20、23、25、27和30 d的果实为研究对象,通过转录组测序获得HXK蛋白序列,反转录PCR克隆HXK基因,使用ExPASy、Plant-PLoc、Phobius和SMART等在线工具对HpHXK蛋白进行生物信息学分析,利用Clustal W进行氨基酸序列多重比对,采用MEGA 7.0邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育进化树;构建pGEX-4T-HpHXK载体并转化至烟草叶片;分析HpHXK基因在不同组织中的表达模式并利用比色法测定重组蛋白的酶活性。【结果】HpHXK基因开放阅读框(ORF)长度为1410 bp,编码469个氨基酸残基。生物信息学分析表明,HpHXK蛋白相对分子量为52.47 kD,理论等电点(pI)为5.42,该蛋白具有HXK特征结构域。系统发育进化树结果显示,HpHXK序列与水稻、拟南芥、苹果、梨、葡萄和枇杷的HXKs聚为一类。HpHXK基因在花后20 d果实中的相对表达量最高,显著高于花后25、27和30 d果实及成熟茎(P<0.05)。亚细胞定位结果显示,HpHXK蛋白定位于细胞质和细胞膜。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果显示,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,重组质粒表达产物与预期相对分子质量一致,表明成功获得HpHXK重组蛋白。HpHXK蛋白对葡萄糖[米氏常数(Km)=0.61 mmol/L]的亲和力高于果糖(K_(m)=2.92 mmol/L)。【结论】HpHXK蛋白具有HXK家族保守结构域,在红肉火龙果果实发育期间,HpHXK基因负向调控果实可溶性糖积累,在细胞质中催化以葡萄糖为主的己糖磷酸化。

马铃薯HXK基因家族鉴定及表达特征分析

为探究马铃薯HXK家族功能,研究利用生物信息学方法对马铃薯HXK基因家族成员进行鉴定,并采用实时荧光定量PCR对该基因在不同模拟逆境胁迫下的表达进行分析,利用同源比对方法从马铃薯基因组中鉴定获得6个马铃薯HXK基因,分别命名为StHXK1-StHXK6。该家族基因分别分布于马铃薯的6条染色体上,其编码蛋白长度为496~533 aa,等电点为5.36~6.11,分子量在53736.38~58184.71 D,均为亲水蛋白。亚细胞定位预测表明,StHXK家族成员主要在叶绿体中表达。该家族成员二级结构均以α-螺旋和不规则卷曲为主,三级结构高度相似。顺式元件分析发现马铃薯HXK基因主要包含光响应元件、激素响应元件、胁迫响应元件及生长发育相关元件。qRT-PCR结果表明,StHXK基因在ABA诱导下均上调表达显著,50μmol/L ABA胁迫下,StHXK1和StHXK2在处理24 h相对表达量较高,分别为对照的286.4倍和152.02倍,200 mmol/L NaCl处理下,除StHXK1和StHXK4基因相对表达量在处理时间2 h呈上调表达,其余StHXK基因均呈不同程度的下调表达。在10%PEG胁迫处理下,StHXK基因相对表达量呈不同程度的上调表达。综上所述,StHXK基因对ABA、NaCl和PEG胁迫处理均存在不同程度的响应。

HXKs基因在香蕉果实后熟过程中功能初探

香蕉是世界主要水果之一,对乙烯非常敏感,属于呼吸跃变型果实。目前,香蕉果实后熟机理还未完全探明,后熟过程中己糖激酶(HXK)与乙烯的关系还不清楚。通过BLAST比对从香蕉基因组数据库中发现HXK基因家族的11个成员,经克隆获得这些基因的序列,并研究HXKs基因在香蕉果实自然后熟过程中的转录表达谱,重点研究乙烯利、甘露糖、NAG和1-MCP对HXKs基因表达、HXK酶活和内源乙烯生物合成的影响。结果表明:在香蕉果实后熟过程中HXKs基因呈现差异性表达,乙烯利上调大多数HXKs基因的表达和HXK酶活,1-MCP的作用正好相反,这表明外源乙烯正作用于HXK。另一方面,甘露糖加快内源乙烯生物合成,NAG却推迟内源乙烯生物合成,这说明HXK正作用于内源乙烯生物合成。所以,在香蕉果实后熟过程中乙烯和HXK之间存在相互促进的关系。这将为进一步阐明香蕉果实后熟机制提供理论依据,也将为香蕉果实保鲜新技术的挖掘提供新思路。

葡萄HXK基因家族的鉴定与表达分析

为了对葡萄HXK基因家族进行鉴定和表达分析,利用拟南芥和玉米的HXK(Hexokinase)基因注册序列,从葡萄全基因组中鉴定得到HXK基因4个,并命名为VvHXK1、VvHXK2、VvHXK3和VvHXK4,对其进行生物信息学分析。蛋白质理化性质分析结果表明,每个基因编码的氨基酸个数分布在412-524 aa,VvHXK4是碱性蛋白,其余3个均为酸性蛋白;亚细胞定位分析表明,4个VvHXK基因都在细胞质中表达,且VvHXK4主要定位于叶绿体,而VvHXK2也存在于线粒体和细胞核中;蛋白质的二级结构预测表明,4个VvHXK基因编码的蛋白主要以α-螺旋为主;外显子结构分析表明,除VvHXK1含10个外显子外,其余3个都有9个外显子,说明VvHXK基因比较保守;启动子顺式作用元件分析表明,4个VvHXK基因均含有ABA响应元件和MYB及WRKY转录因子的结合区域,而VvHXK4中没有发现低温响应元件;系统进化树分析表明,VvHXK1与拟南芥AtHXK1的同源关系最近,推测其不仅具有调节生长发育,影响根系的生长等功能,而且具有加速衰老的作用。VvHXK2与马铃薯StHXK1的同源关系最近,推测其具有使叶绿体中的葡萄糖磷酸化活性升高的功能。VvHXK3与马铃薯StHXKRP1的同源关系最近,可能具有诱导离体叶片中糖表达的作用。VvHXK4与菠菜SoHXK1的同源关系最近。荧光定量分析表明,VvHXK2、VvHXK3和VvHXK4均在20 g/L的葡萄糖处理下相对表达量最高,即其对葡萄糖磷酸化最显著,在果糖和蔗糖的处理下表达量较低。