佛波酯对人胃癌细胞Ha-ras基因启动子及启动子结合蛋白的影响

目的探讨佛波酯(PMA)对人胃癌细胞BGC-823 Ha-ras基因启动子活性及启动子结合蛋白活性的影响。方法通过RT-PCR和运用自行构建的真核表达载体prasEYFP转染细胞进行荧光细胞检测,并应用凝胶电泳移动检测S、outhwestern blotting等方法检测PMA(100μg/L)处理BGC-823细胞72和96 h后,对Ha-ras基因表达水平、Ha-ras基因启动子活性以及对Ha-ras启动子结合蛋白的影响。结果经PMA(100μg/L)处理72和96 h,与未处理细胞相比,BGC-823细胞中Ha-ras基因表达显著降低,Ha-ras基因启动子活性分别被抑制65.2%和71.8%;同时两个Ha-ras启动子结合蛋白活性也显著降低,经检测,其分子量分别约为18 kD,35 kD。结论PMA长期处理通过降低人胃癌细胞中Ha-ras启动子结合蛋白活性使Ha-ras启动子活性被抑制,从而在转录水平上调节Ha-ras基因表达。

银杏叶绿素a/b结合蛋白基因(GbLhcb4)及其启动子克隆

为了探究银杏中叶绿素a/b结合蛋白基因(Gb Lhcb4)的结构及其相关的转录调控元件,基于Roche454高通量测序获得的Gb Lhcb4基因片段,采用RACE技术分离得到该基因的c DNA序列,并通过染色体步移技术获得该基因启动子序列,结合生物信息学技术分析基因序列的特征、系统进化地位及启动子区域的转录调控元件。序列分析表明,Gb Lhcb4基因全长1 200 bp,含有一个834 bp开放阅读框,编码277个氨基酸,相对分子量为30.65 k D,等电点为5.17。同源分析表明,该基因编码蛋白与北美云杉Ps Lhcb4蛋白(Gen Bank登录号:ABK21281.1)相似性最高,为74.7%。启动子顺式作用元件预测表明,启动子区域包含多个光响应元件及逆境响应元件,同时还存在激素响应、组织特异性表达、细胞周期等相关调控元件。此研究分离得到银杏Gb Lhcb4基因及启动子序列,并进行了相关的生物信息学分析,为探究银杏Gb Lhcb4基因应答环境信号的转录调控机制提供了分子基础。

拟南芥钙调素结合蛋白基因启动子的克隆及表达

采用PCR技术从拟南芥中克隆了SCBP60g基因的启动子,并与GUS报告基因融合构建重组表达载体,转化野生型拟南芥,对获得的转基因株系进行GUS组织染色,从基因调控水平上探讨其在功能方面的差异。结果显示:SCBP60g基因的启动子能指导GUS报告基因在拟南芥的根、茎、叶和花中表达,并且在这些部位的维管束表达较强。这种表达方式与LCBP60g基因的启动子指导的GUS基因组织化学染色有差异,表明这个启动子的表达调控具有一定的特异性。

噬菌体展示技术筛选HBV前-前-S抗原基因启动子结合蛋白基因

目的:筛选乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S抗原基因启动子的结合蛋白. 方法:应用噬菌体表面展示技术,以HBV前-前-S抗原基因启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“黏附-洗脱-扩增”的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,并对所筛选克隆进行DNA测序和生物信息学分析. 结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的43个克隆中得到20 个与HBV前-前-S抗原基因启动子特异结合的阳性克隆, 包括人类SMG-1的磷脂酰肌醇3相关激酶激酶、28 S核糖体、单倍型As2A线粒体、组氨酰-tRNA合成酶、脂肪醛脱氢酶、桥粒相关蛋白、MAX相互作用蛋白1等17个已知功能基因及3个未知功能基因. 结论:用噬菌体人肝细胞cDNA文库筛选得到HBV前-前- S抗原基因启动子的结合蛋白基因,为进一步研究HBV发病机制创造了新的途径.

Squamosa启动子结合蛋白基因家族在美国水稻微核心种质中的遗传结构分析

SQUAMOSA promoter-binding-like(SPL)基因家族作为一个植物特异转录因子家族,已被证实具有许多重要的生物学功能。本研究利用19条水稻SPL基因序列设计的引物,对引自美国农业部的171份水稻微核心种质的Oryza sativaL.SQUAMOSA promoter-binding-like(OsSPL)基因家族进行多态性分析。19对OsSPL基因引物扩增出140个条带,其中128个条带具有多态性,占91.4%;平均每个位点检测到7.4个条带。聚类与主坐标分析将171份材料划分为6类,类内品系呈相似地理生态分布,类与类之间无亚洲栽培稻与非洲栽培稻分化。性状关联分析表明,OsSPL基因家族的基因与每穗粒数、株高和抽穗期相关联。

应用酵母单杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ的结合蛋白

目的:寻找与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(SPⅠ)相互作用的特异性结合蛋白,进一步探讨肝细胞中的蛋白对于HBV复制和表达的调节作用,阐明其分子作用机制。方法:应用酵母单杂交体系,以3重复串连的SPⅠ核心序列为“诱饵”,对酵母细胞中的人肝细胞cDNA文库进行筛选,应用DNA序列测定及生物信息学方法对筛选出的结果进行分析。结果:共获得了12个双阳性克隆,编码10种不同的蛋白。其中有3个未知功能蛋白,其余为血清类粘蛋白2、丝氨酸脱水酶、人肝细胞生长因子样蛋白等蛋白。结论:这些蛋白在酵母细胞内SPⅠ核心序列结合,可能是作用于SPⅠ的反式作用因子,但它们对HBV-SPⅠ是否有转录调控作用,笔者正进行进一步的研究。

HBsAg基因启动子Ⅰ DNA结合蛋白1下调IL-18基因启动子

目的:研究HBsAg基因启动子I DNA结合蛋白1(SBP1)与白介素-18(IL-18)基因表达的关系,研究SBP1在HBV致病的分子生物学机制中的作用. 方法:构建质粒pcDNA3.1(-)-SBP1,pCAT3-IL-18,转染HepG2细胞进行表达,应用酶联免疫黏附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性. 结果:构建的表达载体pcDNA3.1(-)-SBP1经过序列分析和酶切鉴定正确.真核表达载体pcDNA3.1(-)-SBP1和pCAT3-IL-18P共转染的HepG2细胞的pCAT表达活性是pCAT3空载体的0.37倍,是转染pCAT3-IL-18P的0.17 倍,抑制率达到86.32%. 结论:SBP1可以下调IL-18启动子的活性,抑制IL-18基因的表达.

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA的结合蛋白

目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白,探索NS5A-TP9的表达调节机制。方法:应用噬菌体展示技术,以聚合酶链反应(PCR)技术扩增的NS5A-TP9启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,回收产物构建克隆载体,对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。结果:噬菌体经富集后,筛选出10个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定了与HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合的蛋白有:补体C3、甲胎蛋白、人血清白蛋白、人核糖体蛋白20S和α1微球蛋白。结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HCV NS5A蛋白反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究NS5A-TP9基因的转录调节机制,进一步阐明HCV非结构蛋白NS5A的致病机制奠定了基础。

三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A1启动子区基因多态性与高血压及血脂关系的研究

ATP结合盒转运蛋白A1（ABCAl）是位于细胞膜上的一种重要的TC流出调节蛋白（CERP），其重要功能之一是将细胞内的TC转运到细胞外，再经HDL—C运送至肝脏，经一系列代谢转化为胆汁酸，排入肠道，从而完成TC的代谢。因此，ABCAl介导的细胞内TC流出，是TC逆向转运的起始环节。

乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1的基因克隆化研究

目的:发现了与乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ(HBV- SP Ⅰ)结合的未知功能蛋白,并克隆了他的全长基因. 方法:以SP Ⅰ核心序列为“诱饵”,应用酵母单杂交技术对人肝细胞cDNA文库进行筛选,得到了一个未知基因,命名为乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1(SBP1).结合生物信息学技术,应用分子生物学技术,克隆了SBP 1的基因编码序列. 结果:经酶切和测序鉴定,结果正确,成功克隆了SBP 1 的基因编码序列. 结论:SBP 1具有完整的开放读码框,可能通过与SP Ⅰ的结合发挥生物学作用.

奶山羊心脏型脂肪酸结合蛋白(FABP3)基因启动子的克隆及活性分析

心脏型脂肪酸结合蛋白(FABP3)是一种15 kDa的蛋白,涉及信号转导途径,参与长链脂肪酸的摄取及利用。本研究采用PCR技术扩增FABP3启动子序列,通过缺失分析构建了5个不同缺失片段荧光素酶报告基因载体,并转染奶山羊乳腺上皮细胞,通过双荧光素酶报告基因系统检测FABP3缺失片段启动子活性。结果表明:从奶山羊基因组中克隆得到2109 bp FABP3基因启动子序列(包括转录起始位点上游1985 bp),与牛(KJ649748.1)、猪(HM591296.1)和人(NG047049.1)的基因组序列同源性分别为90%、80%、75.08%。经转录因子在线软件预测分析发现,该启动子含有潜在的TATA框(TATA-box)、过氧化物酶增殖物激活受体反应元件(PPRE)、肝X受体反应元件(LXRE)、雌激素受体(ER)及两个环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)的结合位点,分别位于-1632 bp和-189 bp。缺失突变研究发现,启动子片段-1801~+124活性最高,同时这一片段含有两个CREB结合位点,而当缺失至-80位点时,活性显著下降(P<0.05),且这一片段不包含CREB结合位点。表明CREB可能参与调控FABP3基因启动子的活性,为FABP3基因的转录调控研究提供理论依据。

8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞p16基因启动子DNA结合蛋白及其mRNA表达的影响

目的 :应用Southwestern技术研究 8 Br cAMP和槲皮素 (quercetin)对Eca 10 9细胞DNA结合蛋白与p16基因启动子区的结合调控mRNA表达的影响。方法 :将贴壁培养的Eca 10 9细胞随机分成 3组 ,Br组 :加 8 Br cAMP至终浓度为 2× 10 5mol/L ;Q组 :加槲皮素至终浓度为 4 3μmol/L ;C组 :不加任何药物 ,只加入新培养液培养。同时培养 4 8h ,应用质粒提取及限制性酶切回收目的DNA片段 ,采用生物素随机引物标记探针 ;应用DNA斑点印迹技术检测探针的灵敏度后以Southwestern印迹技术检测与p16基因启动子区特异性结合的DNA结合蛋白 (DBP) ;以原位杂交检测p16基因mRNA的表达情况。结果 :实验组条带强于对照组 ,Br组强于Q组 ;核基质DNA结合蛋白主带位于Mr6 6 0 0 0、5 80 0 0和 2 0 0 0 0 ;核外DNA结合蛋白主带位于Mr4 0 0 0 0、2 80 0 0和 2 0 0 0 0 ;2者中 2 0 0 0 0是共同成分。原位杂交技术显示p16基因mRNA蓝紫色信号颗粒位于胞质 ,杂交信号以实验组较强。结论 :8 Br cAMP和quercetin尤其是前者作用于人食管癌Eca 10 9细胞 ,诱导产生与p16基因启动子结合较强的DBP 。

重金属增强核因子与水稻金属硫蛋白基因启动子的结合(英文)

植物金属硫蛋白(metallothioneins,MT)被认为在植物应答重金属胁迫方面发挥了重要作用,但该基因的转录调控机制目前仍不清楚.我们以前的研究初步鉴定出位于-331/-194的水稻MT基因(ricMT)启动子区对于金属激活ricMT的表达是必需的.为了明确-331/-194启动子序列在控制ricMT表达中的作用,本课题开展了该序列与核因子的结合特性研究.从2周龄水稻嫩叶中提取了几乎不含叶绿体污染的细胞核,并制备了核蛋白用于凝胶阻滞实验,发现核因子能够与-331/-194启动子序列特异结合.本研究还进一步考察了重金属对核因子结合活性的影响,发现在结合体系中去除重金属离子,核因子与-331/-194序列的结合能力会丧失,而在结合体系中加入重金属离子,结合能力则会随着外加的离子浓度提高而增强,证明这种结合确实依赖于重金属.这些证据结合以前的结果表明,某些金属响应的核因子可能通过结合-331/-194启动子区域来调控ricMT基因表达.

性激素结合球蛋白基因启动子(TAAAA)n重复多态与卵巢早衰的关联性

目的探讨性激素结合球蛋白(SHBG)基因启动子(TAAAA)n重复多态与卵巢早衰(POF)的关联性。方法应用聚合酶链反应及变性聚丙烯酰胺凝胶分离技术检测75例POF患者及167例卵巢功能正常的对照女性SHBG基因启动子(TAAAA)n多态性,比较并分析其在两组中的重复情况。结果 POF组和对照组的SHBG基因启动子(TAAAA)n重复范围分别为6~11次和4~10次,两组等位基因均值分别为(7.85±1.31)和(7.24±1.60),差异有统计学意义(P<0.05)。SHBG基因(TAAAA)n长重复多态(n≥8)在POF组和对照组分布分别为32.0%和20.4%,SHBG基因(TAAAA)n短重复多态(n<8)在POF组和对照组中的分布分别为68.0%和79.6%,长、短多态分布差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SHBG基因启动子(TAAAA)n多态可能与POF发病有关。

斑马鱼MIB1启动子及互作基因的功能富集分析

目的分析斑马鱼E3泛素蛋白连接酶1(MIB1)基因启动子区转录因子结合位点(TFBS),MIB1互作基因和互作蛋白的种类及其在信号通路中的作用,探讨MIB1基因的调控方式及潜在功能。方法利用国家基因组科学数据中心(NGDC)预测非编码RNA(ncRNA),利用Alggen与AnimalTFDB在线网站预测MIB1基因TFBS种类,使用GeneMANIA与STRING分析MIB1的互作基因与互作蛋白;通过DAVID网站获取相关数据,进行基因本体(GO)可视化分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)代谢通路分析。结果MIB1基因启动子区及5′非翻译区可转录出ncRNA;通过预测得到121种TFBS,并发现P53转录因子既可以结合到MIB1基因的启动子区又可与MIB1蛋白相互作用;在线预测出6种MIB1的共表达基因,筛选出20种互作基因;通过GO可视化分析发现,MIB1及其互作基因在生物过程方面具有调控细胞、组织、器官生长分化及调节NOTCH信号通路等功能,且主要在细胞质核周区、细胞膜和突触后密集区等部位被富集,具有结合NOTCH蛋白、PDZ结构域蛋白等分子功能;KEGG代谢通路分析发现,MIB1及其互作基因涉及4条代谢途径。结论MIB1包含多种TFBS,并通过与特定转录因子的相互作用,影响细胞癌变、免疫调节等多种生物学过程。MIB1还可能通过其互作基因和互作蛋白的介导,在细胞生长调控、造血干细胞分化、胚胎发育及神经元信息的传递等方面发挥重要作用。

毛细管电泳技术分析PDGF-B基因启动子与蛋白质的复合物

利用 1.0 %T ,0 %C的线性聚丙烯酰胺 (即丙烯酰胺和双丙烯酰胺的总质量分数是 1.0 % ,交联度为 0 % )作为筛分介质 ,对人体血小板长生因子 (PDGF) B基因启动子与核蛋白形成的复合物进行了分析。结果显示主要有两种核蛋白与PDGF B基因启动子具有较强的结合能力 ,能形成DNA蛋白质复合物。所得结论与传统凝胶电泳相似。该方法具有较高的分离度和良好的重现性 ,整个分析可在 5 0min内完成。该方法不失为一种基于PDGF为研究目标、用于PDGF与蛋白质复合物形成及抑制行为分析的快速、准确的实用方法。

人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人NOD8基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:用特定的限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD8基因启动子不同长度2段序列,并进行酶切以切除启动子的pEGFP-C2作框架结构,插入表达载体pEGFP-C2中,构建含有人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp),用VspⅠ和NheⅠ双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析。构建的重组质粒经脂质体(lipofectam ine)TM2000介导转染HEK293、K562和HeLa细胞,转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察。结果:pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的2段重组质粒转染HEK293、K562及HeLa细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-NOD8(760 bp)重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-NOD8(520 bp)。结论:成功构建2段不同长度的人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。

非小细胞肺癌患者血浆 RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO 基因甲基化状态观察

目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆抑癌基因runt相关转录因子3(RUNX3)、ras相关结构域家族基因1A(RASSF1A)、3-0-硫基转移酶-2(3-OST-2)、死亡相关蛋白激酶(DAPK)、膜结合受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O(PTPRO)等基因启动子区域的甲基化状态。方法采用甲基化特异PCR技术对63例NSCLC患者血浆中RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因是否甲基化进行观察,并以25例健康人作对照。结果 NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率分别为46.0%、50.8%、26.9%、34.9%、41.3%;健康人血浆中甲基化PTPRO基因检出率为12.0%,而甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK均未检出;两者甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率相比,P均<0.05。NSCLC患者血浆中上述5种甲基化基因联合检测的敏感度为88.9%、特异度为88.0%。血浆甲基化RUNX3基因检出率与NSCLC的病理类型、临床分期以及分化程度有关(P均<0.05);甲基化RASSF1A基因检出率与NSCLC的分化程度有关(P<0.05)。结论 NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率明显高于健康人。联合检测血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因有可能会有助于NSCLC的早期诊断及其生物学行为的判断。

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6上调新生多肽相关复合物α多肽基因的表达

目的:探讨HCV核心蛋白结合蛋白6对新生多肽相关复合物α多肽启动子的激活作用.方法:以基因表达谱芯片技术筛选HCBP6表达质粒转染HepG2细胞后的差异表达基因为基础,利用生物信息学技术确定NACA的启动子区域(NACA-p),聚合酶链反应(PCR)扩增NACA-p,克隆至真核表达载体pCAT3中,构建pCAT3-NACA-p表达载体;以该质粒转染COS-7、NIH3T3细胞系,用酶联免疫黏附方法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;与pcDNA3.1(-)-HCBP6共转染NIH 3T3细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:质粒pCAT3-NACA-p在NIH 3T3、COS-7细胞中能够激活CAT的表达;共转染实验中pCAT3-NACA-p+pcDNA3.1(-)-HCBP6组CAT的表达活性是pCAT3-NACA-p的4倍.结论:pCAT3-NACA-p具有启动子活性;HCV核心蛋白结合蛋白6对NACA-p有激活作用.本研究为探讨HCV核心蛋白结合蛋白6的功能提供新的实验及理论基础.