应用DNA测序技术检测血友病B患者FⅨ基因突变

为了研究3名中国汉族非亲缘系血友病B患者凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因突变的类型,常规检测患者血浆APTT及FⅨ∶C,进行表型诊断;抽提患者外周血白细胞基因组DNA,应用PCR技术分8段扩增FⅨ基因外显子序列,用双脱氧终止法检测核酸序列。结果表明:与正常对照者相比,HB患者APTT测定值明显升高,FⅨ∶C测定值明显降低,PT测定值正常。测序结果显示3例HB患者均有相应的基因序列改变,患者1有外显子6G22119A点突变,患者2有外显子1G7932C点突变,患者3有外显子T32685C点突变。结论:3例HB患者均检测到相应的基因序列改变,这为HB患者基因缺陷的分子机制提供了证据。

血友病B携带者及产前基因诊断的研究

目的探讨血友病B家系分子致病机制及基因诊断携带者和高危胎儿。方法采集5个典型血友病B家系成员的标本,提取基因组DNA后PCR扩增和序列比对凝血因子Ⅸ的8个外显子及其侧翼序列;利用基因外6个STR位点进行连锁分析。结果序列分析表明5个家系患者分别存在6485C→T(Arg37stop)、6364C→T(Arg-4Trp)、6409G→A(Gly12Arg)、6364C→T(Arg-4Trp)、30383G→C(Val135Leu)突变;家系1的III2和IV1、家系2的I1、家系4的II8和III6均携带家系中患者的杂合突变;发现1例女性胎儿携带致病基因,其余2例胎儿未见突变;连锁分析结果与序列分析一致。结论替换突变可能是这5个家系致病的分子机制;在严格的质量控制下,序列突变分析结合连锁分析是血友病B携带者和产前基因诊断准确而快速的方法。

血友病B家系的基因测序与高危胎儿的产前诊断

目的:对3个血友病B家系进行凝血因子Ⅸ(F9)基因突变分析,并对家系中的4个高危胎儿行产前诊断。方法:采用PCR反应和扩增后DNA直接测序技术对3个家系先证者及其家系成员F9基因的8个外显子进行序列分析,确定先证者及携带者的基因型后取羊水或绒毛进行产前诊断。结果:3个家系患者中均检出了F9基因突变,分别为G79R(c.10487G>A)、17788DelG、IVS2+4A>T(c.6493A>T)突变,其中,17788DelG为国内外首次报道的突变。女性携带者中检测出上述位点的杂合突变。家系1和家系2中行产前诊断的男性胎儿未携带F9基因突变,家系3中女性胎儿携带有IVS2+4A>T杂合突变,出生后随访均证实产前诊断的结果。结论:F9基因G79R、17788DelG、IVS2+4A>T是3个血友病B家系的致病性突变,应用基因测序技术可以对血友病B家系行有效的基因和产前诊断。

F9基因Arg327Ile新突变导致血友病B的分子发病机制研究

目的探讨F9基因Arg327Ile(R327I)突变导致血友病B的分子发病机制研究。方法对1名血友病B患者作实验室和基因诊断,定点突变法构建F9基因R327I突变的表达质粒;瞬时转染HEK293细胞,一期法检测细胞上清液中凝血因子Ⅸ活性(FⅨ∶C),ELISA法检测细胞上清液和裂解中FⅨ抗原(FⅨ∶Ag),Western blotting检测R327I突变蛋白的分子量及表达量;免疫荧光共定位染色法检测突变蛋白在内质网和高尔基体内分布。结果瞬时表达显示该患者突变细胞标本上清液中R327I突变型FⅨ∶C为野生型的4.49%,明显降低;细胞上清液和裂解液FⅨ∶Ag分别为野生型的31%和129%,为交叉反应物质减低型(CRMR)。Western blotting显示细胞上清液中R327I突变蛋白分子量与野生型相同,但含量比野生型明显降低;免疫荧光共定位染色显示R327I突变蛋白在内质网中分布较野生型多,而在高尔基体中较野生型少。结论 F9基因R327I突变影响蛋白质合成和分泌,突变蛋白较野生型表达量偏低,同时R327I突变蛋白存在凝血功能缺陷从而导致血友病B。

联合多个STR位点对血友病B家系进行携带者检出与产前基因诊断

目的通过血友病B家系遗传连锁分析,建立其产前诊断方法。方法应用PCR方法,检测了三个血友病B家系(16人)凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因外6个STR位点的多态性,并进行家系遗传连锁分析。结果成功地对家系A进行了产前诊断,6个STR位点中3个提供了遗传信息,检测出待诊胎为女性携带者。结论联合多个STR位点多态性检测是血友病B基因诊断的一种简便、快速、有效的方法。

3个血友病B家系患者与携带者的基因诊断

目的:对3个无关联家系的血友病B患者及可能携带者进行基因诊断与分析,以建立家系图谱,为家系的遗传咨询及产前诊断提供依据。方法:提取实验对象DNA,运用PCR扩增及sanger双脱氧链终止法对3个家系成员的FⅨ基因8个外显子序列进行测序比对,并对结果进行分析。结果:3个家系先证者中共发现了3种突变:家系1中先证者基因突变位于第5号外显子,类型为22724del1(Ala164Glnfs*10),家系2中先证者基因突变位于第6号外显子,类型为25510_25514del5(Gly236Ilefs*6),家系3中先证者基因突变位于第7号外显子,类型为35068_35070del3(Val263del),均为未经报道的突变类型,其中家系3中发现携带者1例,基因突变类型与家系3中先证者基因突变类型相同。结论:本次基因诊断为3个家系建立了家系图谱,其结果不仅补充了血友病B的突变数据库,也为血友病B发病的分子机制提供了一定分析依据。

血友病B基因治疗进展

血友病B是一种严重的凝血功能缺陷遗传病 ,由于现行的治疗方法对血友病B的治疗效果均不令人满意。因此 ,有必要开展血友病的基因治疗研究。本文介绍了血友病B的发病机理以及以反转录病毒载体为工具进行血友病B基因治疗的研究进展。

小鼠胚胎干细胞凝血因子Ⅸ基因的定向敲除

目的：将小鼠胚胎干细胞中凝血因子Ⅸ（ｍＦⅨ）基因定向敲除，为建立血友病Ｂ的转基因小鼠模型奠定基础；摸索建立ＥＳ细胞基因打靶技术体系。方法：将线性化的针对小鼠ｍＦⅨ基因组的基因打靶置换型载体（ｐＭＦⅨＤＥＬ）ＤＮＡ用电穿孔法转入小鼠ＥＳ细胞，经过Ｇ４１８和ＧＡＮＣ分组药物选择，用ＰＣＲ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交两种方法，鉴定药物抗性细胞中发生同源重组的情况。结果：（１）从药物抗性细胞克隆中鉴定获得了４个发生了按所设计的方式进行了同源重组的ＥＳ细胞克隆；（２）观察到在ＥＳ细胞中，ｐＭＦⅨＤＥＬ载体ＤＮＡ与内源ｍＦⅨ基因发生同源重组的频率平均为１．６７×１０－６。结论：得到了４个ｍＦⅨ基因已被敲除的ＥＳ细胞克隆；建立了ＥＳ细胞基因打靶的技术体系。

一例直肠息肉合并乙型血友病患者EMR术后迟发性出血的护理体会

结直肠息肉是结直肠常见疾病之一,临床上大部分息肉都可采用内镜下切除,内镜具有操作简便、创伤小和切除彻底的优势^([1]),但并发症并不少见。内镜下肠息肉切除术后最常见的并发症是出血,发生率为0.4%~10.2%^([2-3]),包括术中出血和迟发性出血(DPPB)^([4])。术后DPPB原因除了病人因素如长期使用抗凝剂、息肉基底部宽度≥1.0cm等危险因素外,术后创面处理不良如高频电凝使用不当、创面闭合不当等也是常见原因^([5-7])。

联合多个微卫星DNA位点进行血友病B基因诊断

目的 建立简单、快速的血友病B遗传学诊断方法。方法 应用PCR和Genescan等方法分别检测 87名正常人和 8个血友病B家系 (35人 )的 8个STR位点的多态性 ,并进行家系遗传连锁分析。结果 所检测的 8个STR位点中 6个可提供遗传信息 ,其杂合度在 5 0 %～ 83%,PIC在 0 .39～0 .80 ,个别识别能力在 0 .6 6～ 0 .94。结论 联合多个STR位点多态性检测是血友病B基因诊断的一种简便有效的方法。

中国汉族血友病B家系五种新的FⅨ基因突变的研究

目的探讨中国汉族无关血友病B家系先证者的凝血因子Ⅸ基因的突变和发病的分子机制。方法对19例中国汉族无关血友病B家系先证者,静脉采集各家系先证者外周血,表型诊断确诊后,用PCR对FⅨ8个外显子及其侧翼序列进行扩增,用末端标记双脱氧法检测核酸序列。结果19例血友病B家系先证者均检测到相应的基因序列的改变。结论19例中国汉族无亲缘关系的血友病B家系先证者FIX基因在编码外显子的核苷酸部位均发现有基因突变,其中发现五种新的突变,即6444T→A(Cys23Stop);10497G→C(Cys82Ser);31101G→T(Arg327Ile);31102InsertT;30984T→G(Ile288Ser)为国际上首次报道。

三个血友病B家系的基因诊断

目的探讨中国汉族3个无关血友病B家系先证者凝血因子Ⅸ（FⅨ）基因突变及分子发病机制，对家系女性成员进行携带者诊断。方法家系先证者及成员采静脉血，先证者表型诊断确诊后，检测先证者及其家系成员6个STR位点的基因多态性，进行家系遗传连锁分析，应用PCR法对先证者及可疑携带者FⅨ8个外显子及其侧翼序列进行扩增，用末端标记双脱氧法检测核酸序列。结果家系1先证者FⅨ基因外显子6发现G22119A突变，家系2先证者FⅨ基因外显子2发现G7392C突变，家系3先证者FⅨ基因外显子8发现T32685C突变。结论血友病B先证者FⅨ基因缺陷是其发病的分子机制。

体外表达探讨凝血因子IXArg327Ile新突变导致血友病B的分子发病机制

目的探讨凝血因子Ⅸ（FIX）Arg327Ile（R327I）突变导致血友病B的分子发病机制。方法在野生型FIX表达质粒FIX”peDNA3．1（一）的基础上，定点突变法构建FIXR327I、R327Ala（A）、R327Lys（K）和R327Asn（N）突变的表达质粒，重叠PCR构建FIX324～329（B折叠结构域）换成FVIl298～303同源结构突变表达质粒[FⅨBFVIIpeDNA3．1（一）]。将野生型及各种突变体表达质粒分别瞬时转染胚肾293T细胞，一期法检测培养上清液中FIX活性（FIX：C）及ELISA法检测细胞培养上清和细胞裂解液中FⅨ抗原（FⅨ：Ag），Westernblot法检测突变蛋白的相对分子质量及表达水平。荧光蛋白表达载体瞬时转染法检测活细胞中突变蛋白合成与分泌。结果体外瞬时转染FIXR327I突变基因的细胞FIX：C为正常野生型的4．49％，细胞上清液和细胞裂解液FIX：Ag水平分别为野生型的31．02％和129．29％，为交叉反应减低型（CRMR）。活细胞免疫荧光观察发现FIXR327I突变蛋白在细胞内含量较野生型显著增高，并且在细胞溶酶体内的含量较野生型也显著增多。FIXR327A、R327K、R327N及FIXl3FVII突变基因转染的细胞FIX：c水平较野生型减低，其中以FIXl3FVII突变降低最为明显；转染的细胞培养上清FIX：Ag水平除R327K突变型较野生型增加，其余突变型均比野生型有不同程度的降低。Westernblot法检测显示各种突变蛋白的相对分子质量与野生型相同而表达水平降低。结论FIXR327I突变基因可影响蛋白质合成和分泌，R327位点与FⅨ功能特异有关，其所在的B折叠结构域在FⅨ特异性功能中发挥重要作用。

小鼠凝血因子Ⅸ基因组DNA的结构分析和ES细胞基因打靶研究

为了利用ES细胞基因打靶技术建立人血友病B的转基因小鼠模型，用小鼠FIX基因cDNA为探针，筛选129Sv小鼠的基因组DNA噬菌体文库，从2×105个噬斑中得到5个独立的阳性噬菌体克隆．其中一个（C16）克隆含有约22kb插入片段，经Dotblotting，PCR，部分DNA序列测定和双酶组合分析等，完成了酶切图谱分析和外显子的定位，发现小鼠FIX基因组DNA的结构与人FIX基因组存在区别，主要表现在内含子的大小和序列上．分别选用含有第1，2个外显子的4．5kbBamHⅠ／XbaⅠ片段和含有第7，8外显子的1．8kbBamHⅠ／HindⅢ片段作为基因打靶置换型载体中长短同源臂，定向克隆人通用置换型载体骨架pSSC－9两个多克隆位点中，构建得到预计可以造成含有第3～6个外显子的大片段缺失突变的置换型载体（pMFIXDEL）．用载体两侧的SfiⅠ稀有酶切位点，将pMFIXDEL线性化．通过电穿孔法将25μg载体DNA转人约107个ES细胞中，分成GANC－／G418＋和GANC＋／G418－两组进行10d药物选择（药物浓度分别是GANC：2μmolβ／L，G418：200U／ml，选择从电穿孔后24h开始）．挑取药物抗性细胞，扩大培养后，用PCR和基因组Southern杂交进行药物抗性细胞的分子鉴定，结果获得4个（两个药物选择组分别是2／72，2／7）发生了预计的同源重组的ES细胞克隆，?

重组人凝血因子Ⅷ结构改造的研究进展

血源凝血因子Ⅷ是血液凝固过程中关键因子,为治疗甲型血友病的特效药,但存在价格昂贵、给药频率高和潜在的病毒污染风险等缺点;且由于血液制品来源有限,凝血因子Ⅷ类药物在国内供不应求。随着基因工程技术的发展,药用重组人凝血因子Ⅷ得以实现,在此基础上大量针对重组人凝血因子Ⅷ的结构改造研究不断涌现,部分产品已投放市场。文章主要对哺乳动物细胞表达的各类改构重组人凝血因子Ⅷ的原理和研究进展进行综述。由于存在提高蛋白质稳定性及延长药物半衰期等优势,结构改造将是重组人凝血因子Ⅷ类药物未来的技术发展方向。