重叠PCR法构建副猪嗜血杆菌外源打靶基因

利用重叠PCR法构建了包含副猪嗜血杆菌血清5型hhdA基因上、下游同源臂(H-up、H-down)和卡那霉素抗性基因(Kan)的外源打靶基因Hup-kan-Hdown。通过对反应条件进行优化,发现退火温度为50.5℃,加入H-up、H-down和Kan各为5μL(450 ng)时得到Hup-kan-Hdown的量最多。将此外源打靶基因的两端引入PstI和SacI酶切位点,克隆至具有迁移作用的自杀质粒pDS132,构建了可在大肠杆菌E.coliSM10-λpir中稳定遗传的打靶载体,为下一步建立副猪嗜血杆菌的高效基因打靶系统奠定基础。