绿鲍(Haliotis fulgens)线粒体基因组全序列测定及分析

为高效鉴别鲍属物种和更好地管理和保护鲍种质资源,本研究通过高通量测序获得了养殖绿鲍(Haliotis fulgens)稚贝的线粒体基因组全序列,并对其序列和结构特征进行分析。结果表明,绿鲍线粒体基因组全长17 041 bp,含有37个编码基因,其中蛋白质编码基因13个、t RNA基因22个、r RNA基因2个。13个蛋白质编码基因均以AUG为起始密码子,以UAG或UAA为终止密码子。除t RNA-Ser^((AGN))外的21个tRNA基因可折叠成典型三叶草结构。分析发现t RNA-Glu和COX3间存在富含A+T的非编码区,其内含有2个带回文序列的发卡结构。基于已报道的10个鲍属线粒体基因组全序列构建系统发育树,发现绿鲍与皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)、红鲍(Haliotis rufescens)、黑鲍(Haliotis cracherodii)聚为一支。将绿鲍与皱纹盘鲍13个线粒体编码蛋白的结构域比较,发现二者ND2、ND4的跨膜结构域数量存在差异,这是否与二者的高温耐受性差异有关,有待进一步研究。总之,绿鲍线粒体基因组全序列的首次获取和分析,丰富了鲍类细胞遗传信息,为分类、种质鉴定与种质资源保护提供了基础数据和参考。

鲍营养品质及影响因素研究进展

鲍是一种营养和经济价值较高的优质海产品,富含优质蛋白质、多种氨基酸、多糖、多不饱和脂肪酸、微量元素等多种营养物质和活性成分。近年来,随着消费市场需求的日益增加,鲍产业发展迅速,已成为中国海水养殖业的重要支柱产业。目前,除辽宁省和广东省有少量养殖外,福建省和山东省成为鲍的主产地。现阶段鲍营养品质和性状提升逐渐成为鲍育种养殖业的重要研究方向。本文综述了鲍营养品质方面的研究进展,包括其基本营养成分、呈味和功能活性物质,重点归纳了品种、产地、采样季节、养殖模式、饵料等因素及不同外源胁迫对鲍营养品质的影响。由于影响因素和差异指标繁多,且鲍营养品质的评价缺乏统一的标准,未来亟需系统性开展鲍品质评价研究,以及饵料、环境因子、养殖模式等因素对鲍品质调控机制的研究,以期为鲍养殖、新品种培育、品质综合评价及特征指标挖掘等方面提供科学参考。

基于线粒体COⅠ和Cytb基因探讨北鲍南养对皱纹盘鲍群体遗传结构的影响

为探讨近三十年来我国皱纹盘鲍养殖模式对群体遗传结构产生的影响,利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基(COⅠ)基因和细胞色素b(Cytb)基因分析了定殖漳州的群体、大连培育蓬莱越冬群体、荣成培育福建越冬群体及长山列岛(砣矶岛、大钦岛、南隍城岛)皱纹盘鲍群体的遗传多样性与群体遗传结构。结果显示,在259个个体730 bp的COⅠ序列片段中检测到48个变异位点和30个单倍型,6个群体的单倍型多样性为0.586~0.897,核苷酸多样性为0.0056~0.0081。259个个体730 bp的Cytb序列片段中检测到59个变异位点和32个单倍型,6个群体的单倍型多样性为0.605~0.909,核苷酸多样性为0.0077~0.0120。基于COⅠ和Cytb基因的群体间Fst值以及AMOVA结果表明,绝大部分群体之间存在显著的遗传分化,并且遗传变异主要来源于群体内。现行的皱纹盘鲍北鲍南养模式加强了不同群体之间的基因交流,使不同遗传背景的种群二次接触,导致皱纹盘鲍6个群体均具有较高的单倍型多样性和核苷酸多样性;而各养殖群体中的不同选育条件则可能是造成显著遗传分化的重要原因。本研究对分属南北沿海的6个皱纹盘鲍群体的遗传评估将为我国皱纹盘鲍资源的合理利用以及养殖模式对遗传结构的影响提供科学依据。

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)精子的超微结构

皱纹盘鲍（Ｈａｌｉｏｔｉｓｄｉｓｃｕｓｈａｎｎａｉ）的精子属于“原始型”，由顶体（２．２μｍ×１．０μｍ）、细胞核（３．１μｍ×０．８３μｍ）、中段（０．７４μｍ×１．４μｍ）和鞭毛（５２μｍ×０．２２μｍ）组成。顶体弹头状，由两部分组成：（１）顶体的前端是一呈卵形的高电子密度的部分；（２）顶体的后端为一呈翼状的低电子密度的部分。细胞核呈长柱状。在顶体凹陷和细胞核凹陷之间为顶体下腔，内有微丝束结构。中段包括５或６个线粒体，一对中心粒及一些泡状结构。鞭毛为典型的“９＋２”结构。

酪氨酸酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶基因在皱纹盘鲍初生壳形成中的表达分析

为研究软体动物贝壳发育区形成机制,实验通过扫描电子显微镜观察分析了皱纹盘鲍贝壳发育区的形态特征,鉴定了皱纹盘鲍的酪氨酸酶(Hdi-Tyr1和Hdi-Tyr2)、过氧化物酶(Hdi-Prx1、Hdi-Prx2)和碱性磷酸酶(Hdi-Alp)等5个贝壳形成相关的候选基因,并通过整装原位杂交技术解析了各基因在皱纹盘鲍早期幼虫发育过程中的表达模式。结果显示,皱纹盘鲍贝壳发育区由至少3种特征差异明显的细胞组成,酪氨酸酶基因(Hdi-Tyr1和HdiTyr2)在担轮幼虫的贝壳发育区呈“U”形表达,在面盘幼虫外套膜的长柱状细胞中表达,而碱性磷酸酶(Hdi-Alp)和过氧化物酶(Hdi-Prx1和Hdi-Prx2)基因仅表达在幼虫的担轮环和头部。研究表明,Hdi-Tyr1和Hdi-Tyr2基因可能参与了皱纹盘鲍担轮幼虫和面盘幼虫的贝壳形成过程,而过氧化物酶基因Hdi-Prx1和Hdi-Prx2以及碱性磷酸酶基因Hdi-Alp并不参与初生壳的发育过程,实验结果为深入解析软体动物的贝壳发育机制和贝壳相关性状的种质创新提供了基础支撑。

皱纹盘鲍（Haliotis discus）脓疱病的研究

１９９３年夏季，大连水产养殖公司槽式养殖的鲍（Ｈａｌｉｏｔｉｓ）发生脓疱病，死亡率高达５０—６０％。经分离纯化得９３０１和９３０２二个菌株。镜检结果表明，两个菌株均为极生单鞭毛的革兰氏阴性短杆形细菌。在人工感染试验中，健康鲍足肌分别注射两个菌株的菌液，感染率均高达１００％。病症与自然发病的完全相同。因此，证明９３０１和９３０２菌株即为脓疱病的病原菌。药敏试验表明，两个菌株对氯霉素、复方新诺明高度敏感，对氟哌酸中度敏感。它们的ＭＩＣ值分别为１．５６微克／毫升、３．１２微克／毫升、６．２５微克／毫升。联合药敏试验表明，氯霉素与复方新诺明或氟哌酸、复方新诺明与氟哌酸联合后的ＦＩＣ指数均大于０．５而小于１。因此，它们之间的作用均属累加作用。

我国海域耳鲍(Haliotis asinisna)精子发生的超微结构研究

应用透射电子显微镜技术研究了我国海域耳鲍精子发生的全过程。结果表明,耳鲍精原细胞呈近椭圆形,染色质分布较均匀,线粒体较少;初级精母细胞较大,染色质凝聚成小块状,线粒体增多;次级精母细胞较初级精母细胞小,线粒体较多,部分线粒体发生融合,呈扁囊状。分化早期精细胞染色质凝聚成团块状,多数贴附于核膜内面,胞质中出现前顶体颗粒。分化中期精细胞染色质继续凝聚成较大的团块,线粒体在核的一端融合,形成数量少、体积大的线粒体,前顶体颗粒形成圆形外膜明显的前顶体。分化后期精核由近圆形变成长桶状,核内染色质凝聚并均质化,前顶体泡化发育成顶体,鞭毛形成,精细胞分化成精子。成熟精子为鞭毛型精子,由头部、中段和尾部(鞭毛)3部分组成。

耳鲍(Haliotis asinina)核糖体小亚基(18S rRNA)编码基因的克隆与序列分析

采用分子生物学的方法,对南海不同海区的两个地理群体耳鲍(Haliotis asinina)18S rRNA基因全长进行了克隆和序列分析,并将耳鲍18S rRNA基因的序列与NCBI数据库中已收录鲍的18SrRNA基因进行了比较。结果发现,南海耳鲍核糖体18S rRNA基因与耳鲍H.asinina isolate H11核糖体18S rRNA基因序列的相同率高达98%;同一地理群体内耳鲍核糖体18S rRNA基因序列完全一致;不同地理群体间耳鲍核糖体18S rRNA基因在碱基组成上的相似率为99%,仅在某些位点处发生了碱基替换,即腺嘌呤(T)被鸟嘌呤(G)替换;同时,将这两个不同群体中耳鲍的18S rRNA基因与泰国耳鲍18S rRNA基因序列进行比较分析发现,它们之间也只是发生了碱基替换。

杂色鲍(Haliotis diversicolor)硒结合蛋白1基因的克隆及其应激表达

硒结合蛋白1(selenium-binding protein 1,SBP1)是一种高度保守的蛋白,广泛参与了机体的多个理化过程。本研究首次获得了杂色鲍(Haliotis diversicolor)SBP1基因的全长c DNA序列2269 bp,并命名为Hd SBP1,ORF为1494 bp,共编码497个氨基酸。荧光定量PCR结果显示,Hd SBP1基因在杂色鲍各组织中均有表达,其中在鳃和肾中的表达量相对较高。缺氧处理后,Hd SBP1在鳃组织和血细胞中的表达量分别在处理24 h和192 h后显著升高(P<0.05);高温应激之后,在鳃组织中,Hd SBP1的表达量在第1时相与第3时相显著升高(P<0.05),而在血细胞中只有在第3时相表现出显著性差异;缺氧和高温联合应激之后,鳃组织中Hd SBP1的表达量在192 h显著上调(P<0.05),在血细胞中Hd SBP1的表达量在0 h、4 h和24 h时均显著升高(P<0.05);副溶血弧菌注射感染之后,在鳃组织中Hd SBP1的表达量在6 h和24 h时显著性上调(P<0.05),而血细胞中Hd SBP1基因的表达量在每个时相的实验组都显著高于对照组(P<0.05)。以上不同的应激条件均会导致Hd SBP1在不同组织中的表达量的显著变化,说明Hd SBP1在杂色鲍的免疫反应中可能扮演着重要的角色。

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肠道潜在益生菌的筛选及对幼鲍生长的影响

采用体外实验筛选益生菌结合16SrDNA序列分析法,从124株不具有溶血作用的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肠道细菌中筛选得到5株潜在益生菌并进行了分子鉴定,进一步对5株潜在益生菌进行了安全性实验及体内饲喂实验。结果表明,2株具有拮抗哈维弧菌和灿烂弧菌能力的潜在益生菌分别被鉴定为Shewanella sp.(WA64)和Shewanella sp.(WA65),一株产海藻酸酶和淀粉酶的潜在益生菌被鉴定为Vibrio sp.(WA51),产蛋白酶潜在益生菌被鉴定为Bacillus sp.(FA12),产琼脂酶潜在益生菌被鉴定为Tamlana sp.(FA86);安全性实验表明5株潜在益生菌在107cfu/ml下对皱纹盘鲍没有明显的毒害作用;通过体内饲喂实验发现,潜在益生菌WA64、WA65的复合作用能够显著提高幼鲍增重率和存活率(P<0.05),并在生产条件下能够明显降低幼鲍的死亡量。经抗生素敏感性实验,WA64菌株对15种抗生素均敏感或中度敏感,WA65菌株仅对庆大霉素和链霉素2种抗生素产生耐药。

皱纹盘鲍(Haliotis discushannai Ino)胚胎RNA分离和cDNA文库构建

从皱纹盘鲍胚胎样本中分离RNA并构建了cDNA文库。分别收集孵化8、10和12h的皱纹盘鲍胚胎,用抽滤除菌的海水反复悬浮胚胎,将这3个发育阶段的胚胎样本等量混合后用TRIZOL试剂提取总RNA,将提取物用酚氯仿异戊醇再抽提2次,分离获得高质量的总RNA。从总RNA中分离mRNA,构建了皱纹盘鲍混合胚胎的cDNA文库,未扩增胚胎文库的滴度为5.0×106pfu/ml,重组率为94.12%,插入片段均大于400bp,70.6%克隆的插入片段分布在1000—1500bp之间,扩增后的文库滴度为3.06×109pfu/ml。

杂色鲍Haliotis diversicolor溃疡症病原菌的研究

从患病杂色鲍Haliotisdiversicolor病灶上以TCBS及 2 2 1 6E平板划线各分离到两株致病性细菌 ,经人工感染实验可出现与自然发病相同的症状 ,并从感染鲍分离到同一菌株 ,证明该两株菌为杂色鲍溃疡症的病原菌。这两株菌的特征具明显一致性 :革兰氏阴性 ,短杆状 ,极生单鞭毛。氧化酶和过氧化氢酶阳性 ,淀粉酶、明胶酶阳性及脲酶阴性 ,可还原硝酸盐 ,不能利用柠檬酸 ,不产生吲哚和硫化氢 ,MR阳性、V .P实验阴性 ,发酵葡萄糖产酸不产气 ,O/ 1 2 9敏感 ,0 %和 1 0 %胰胨水中不生长。经鉴定该病原菌为亮弧菌ⅡVib riosplendidus-Ⅱ。还对亮弧菌进行了药敏试验 ,该菌对氨苄青霉素、氯霉素、复方新诺明等药物非常敏感 。

九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)耐低盐与生长性状的遗传参数评估

采用不平衡巢式设计方法和人工授精技术,1个雄九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)配3个雌九孔鲍,建立12个半同胞家系和36个全同胞家系,各家系养殖240d后统计每个家系生长性状,并分别从所建立36家系中随机选取40个稚鲍,在盐度16下进行耐盐实验,48h后统计各个家系的存活率,应用约束最大似然法(Restricted Maximum Likelihood Method,REML)估算九孔鲍体重,壳宽,壳长与耐低盐性状的遗传参数。结果表明,九孔鲍稚鲍在240日龄时,壳长、壳宽和体重遗传力为中等遗传力,估计值分别为0.18±0.04,0.13±0.06,0.18±0.15;耐低盐性状遗传力较低,估计值为0.056±0.022,48h家系的平均存活率为0.44±0.23。壳长,壳宽,体重与耐低盐性状的表型相关与遗传相关系数分别为?0.04—?0.156和?0.03—0.14,呈负相关关系,检验不显著。结果证明,对九孔鲍生长性状与耐低盐性状进行改良时,可采用复合育种技术,以加快育种进程。

杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)消化腺细菌的初步研究

从正常杂色鲍 (无病症 ,腹足吸附力强 )的消化腺分离到 5个细菌菌株 :1 1 3,3 1 1,4 1 1,5 3 3,5 4 3 经VITEK -AMS - 6 0自动鉴定系统鉴定 ,前 4株均为溶藻弧菌 (Vibrioalginolyticus) ,后 1株为恶臭假单胞菌 (Pseudomonasputida) 溶藻弧菌 4个菌株在形态、生理生化鉴定上虽有差别 ,但基本上是一致的 5 4 3恶臭假单胞菌与其它 4株差别较大 溶藻弧菌 4菌株对卡那霉素等 12种药物敏感 ,对青霉素G等 7种药物有耐受性 ,恶臭假单胞菌对卡那霉素等 8种药物敏感 ,对青霉素G等

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)数量性状的相关性与通径分析

为研究皱纹盘鲍各数量性状间的相关性及不同性状对体质量、软体部质量的影响，随机选取161只同一批次3-4龄的皱纹盘鲍，测量其壳长（SL）、壳宽（Sw）、壳厚（SH）、壳质量（SW）、足质量（FW）、软体部质量（MW）和体质量（BW）。计算性状间的相关系数，采用通径分析法计算不同性状对体质量、软体部质量的通径系数和决定系数，定量分析这些性状分别对体质量、软体部质量的影响效应。结果表明：所测各性状与体质量和软体部质量之间的相关系数均达到极显著水平（P＆lt;0.01）；在6个数量性状（壳长、壳宽、壳厚、壳质量、软体部质量、足质量）中软体部质量是影响体质量的主要因素；在体尺性状（壳长、壳宽、壳厚）中壳长对体质量影响最大；在体尺性状和体质量对软体部质量的影响中，体质量起主要作用。去除通径系数检验不显著的性状，利用逐步回归的方法，建立了6个数量性状对体质量的回归方程：BWq=-10.343＋0.255SL＋0.696SW＋0.951MW；体尺性状对体质量的回归方程：BWb=-69.930＋1.427SL＋0.728SH；体尺性状和体质量对软体部质量的回归方程：MB=4.430＋0.798BW-0.174Sw。研究结果为皱纹盘鲍的种质资源保护和选育工作提供一定的理论依据。

九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)育苗期养殖水体细菌的群落结构

为研究九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)育苗期养殖水体细菌的群落结构,用细菌通用引物构建了细菌16S rRNA基因克隆文库.从文库中随机挑选31个克隆子进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析,得到20个不同的RFLP带型.对代表性克隆子进行测序,序列分析和系统进化分析结果表明鲍苗养殖池水体中细菌遗传多样性非常丰富.主要分为3大类群:γ-变形菌纲、α-变形菌纲和黄杆菌纲细菌,分别占58%、32%和10%.γ-变形菌纲细菌中以弧菌最多,包括已知的鲍病原弧菌,其次是海洋螺菌目细菌.α-变形菌纲细菌主要与GenBank库中未培养的克隆子序列最相似,其中红细菌科细菌最丰富,占所分析克隆子数目的26%.本研究结果表明九孔鲍育苗期养殖水体中存在大量未培养的、未知菌属的细菌.

羊鲍(Haliotis ovina)和耳鲍(H.asinina)MtDNA COⅠ和COⅡ基因片段序列的比较研究

采用基因测序的方法,对我国海南产的羊鲍和耳鲍两个自然种群的COⅠ和COⅡ基因片段进行了PCR扩增和测序。结果表明,羊鲍和耳鲍COⅠ基因片段的核苷酸序列均为193bp,4种碱基组成非常相似,且其A+T的含量也非常相似,分别为45.08%和45.60%。羊鲍和耳鲍COⅠ基因片段的核苷酸序列之间有29bp的差异,其中有8处发生碱基颠换,21处发生碱基转换,差异为15.03%,同源性为84.97%;羊鲍和耳鲍COⅡ基因片段的核苷酸序列均为157bp,羊鲍和耳鲍4种碱基组成差异较大,且其A+T的含量也不同,分别为59.24%和55.41%。羊鲍和耳鲍COⅡ基因片段的核苷酸序列之间有19bp的差异,其中3处发生碱基颠换,16处发生碱基转换,达到12.10%的差异,同源性为87.90%。分子变异分析表明羊鲍和耳鲍物种间的变异组成为0.50,变异百分数为100.00,羊鲍和耳鲍物种间的遗传分化显著(FST=1,P<0.001)。

南北方养殖不同规格皱纹盘鲍营养成分和呈味物质分析

目的系统探究养殖模式和规格对鲍营养和呈味成分的影响。方法选取全年北方养殖、南北接力养殖和全年南方养殖3种模式下小规格、中规格皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai),分别对其基本性状指标(总重、足肌重和壳长等)、营养成分(基本营养成分、脂肪酸和氨基酸)和呈味物质(游离氨基酸、核苷酸、有机酸和甜菜碱)进行测定和分析。结果小规格南北接力养殖皱纹盘鲍的足肌重[(17.85±0.57)g]、蛋白质[(67.55±5.01)g/100 g]、呈味物质[等效鲜味浓度(equivalent umami concentration,EUC)[(2.06±0.02)g MSG/100 g]、腺苷酸(71.04±8.15)g/100g和琥珀酸(8.16±0.76)g/100g]含量均高于小规格全年北方养殖皱纹盘鲍(P<0.05),但小规格全年北方养殖皱纹盘鲍必需氨基酸总量[(20.12±0.62)g/100g](P<0.05)和必需氨基酸指数(essential aminoacidindex,EAAI)(65.73)高于南北接力和全年南方养殖皱纹盘鲍;中规格全年北方养殖皱纹盘鲍EUC值[(1.64±0.05)g MSG/100 g]显著高于(P<0.05)中规格南北接力养殖鲍,但营养方面反之。3种来源的中规格皱纹盘鲍营养成分含量均高于小规格皱纹盘鲍;除全年北方养殖鲍外,小规格皱纹盘鲍呈味物质含量均高于中规格鲍。结论不同养殖模式、规格皱纹盘鲍营养成分和呈味品质均有差异,全年南方养殖和南北接力养殖鲍营养品质均优于全年北方养殖鲍,但全年北方养殖鲍呈味品质优于南北接力鲍(小规格除外);同一来源中规格鲍营养优于小规格鲍,但小规格鲍呈味品质均优于中规格鲍(全年北方养殖鲍除外)。本研究结果将为皱纹盘鲍养殖、消费、加工及其营养品质评价提供有力数据支撑。

产褐藻酸盐裂解酶菌株Shewanella haliotis BP-1的产酶条件优化

为了获得能够将褐藻酸盐水解成为单糖的褐藻酸盐裂解酶,以便于在褐藻生物质能源生产过程中对褐藻的糖化处理,对筛选分离获得的产褐藻酸盐理解解酶菌株Shewanella haliotis BP-1进行产酶条件的初步优化。初步确定了产酶的条件为温度35℃,初始pH 8.0,摇床转速200r/min,接种量为1%(v/v),装液量为500mL三角瓶装200mL,时间24h。优化后的产酶培养基为1.05%(w/v)K2HPO4,0.45%(w/v)KH2PO4,0.5%(w/v)(NH4)2SO4,2%(w/v)NaCl,0.2%(w/v)MgSO4.7H2O,0.001%(w/v)FeSO4.7H2O,0.4%(w/v)海藻酸钠。优化后菌株Shewanella haliotis BP-1在发酵培养24h后酶的比活力最高为0.92U/μg,此时发酵液的酶活性为28.1U/mL,发酵48h后达到最大酶活30.4U/mL。

多元PCR在黑鲍(Haliotis rubra)微卫星遗传研究中的应用

根据D03等11个微卫星引物单位点PCR扩增时优化的扩增条件(退火温度、MgCl2等)和11个微卫星引物所带有的荧光颜色、等位基因大小变异范围及反应的灵敏度,可将11个微卫星引物分成A组(D03、G04、B04和H08)、B组(A09、H11、A08和G01)和C组(CmrHr1.24、CmrHr2.30和CmrHr2.23)进行多元PCR扩增,结果显示各组内位点之间的分离清晰,这表明多元PCR可以大大提高微卫星检测仪器的使用效率和提高实验效果,在微卫星研究中是一种快速便捷的方法。