根皮苷通过下调小肠NPC1L1和HMG-CoA还原酶表达降低血液胆固醇水平

以高脂高胆固醇膳食喂饲仓鼠为动物模型,研究根皮苷对仓鼠血脂水平及小肠胆固醇代谢相关基因的调控影响。36只实验动物随机分成对照组和3个不同剂量根皮苷干预组(3、6、9 g/kg),测定血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)及高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平,气相色谱法检测肝脏中胆固醇含量及粪便固醇排泄量,实时定量荧光聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,Real-Time PCR)分析小肠胆固醇合成、吸收、转化及排泄基因的表达水平。血脂测定结果显示,血清TC、TG水平随给予根皮苷添加量增加而降低,且高剂量组具有显著性(P<0.05或P<0.01);6、9 g/kg根皮苷剂量组,血清中HDL-C水平极显著升高(P<0.01)。气相色谱检测结果显示,根皮苷剂量组仓鼠肝脏中胆固醇含量较对照组随根皮苷剂量增加而降低,且6、9 g/kg组具有极显著差异(P<0.01);粪便中总中性固醇排泄量与根皮苷给予量正相关,且都具有显著性差异(P<0.05或P<0.01),总酸性固醇排泄量根皮苷剂量组相比对照组增加,且6 g/kg组显著增加(P<0.05),9 g/kg组极显著增加(P<0.01)。Real-Time PCR检测结果显示,根皮苷剂量组小肠中胆固醇合成限速酶HMG-CoA还原酶、小肠胆固醇吸收关键蛋白NPC1L1、胆固醇酯化酶ACAT2、微粒体转运蛋白MTP的mRNA表达水平较对照组显著降低(P<0.05或P<0.01);给予根皮苷后,肠道中促进胆固醇向外排泄基因ABCG5/8表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。因此,根皮苷对高脂高胆固醇膳食饲喂仓鼠胆固醇代谢平衡的调节可能是通过对小肠胆固醇吸收、转化等基因表达的抑制,上调胆固醇排泄基因的表达实现的。

开菲尔对高脂金黄地鼠肠道菌群的调节作用研究

利用高脂金黄地鼠模型研究开菲尔对肠道菌群的调节作用。体质量、肝脏质量、附睾脂肪质量、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定结果表明,开菲尔能够有效控制高脂饲料引起的体质量、附睾脂肪质量增加以及LDL-C/HDL-C比值的升高(开菲尔实验组体质量、附睾脂肪质量、LDL-C/HDL-C比值分别为149.8 g、4.0 g、0.7,显著低于高脂饲料对照组的172.1 g、5.5 g、1.1)。高通量测序分析结果显示,开菲尔能够显著下调拟杆菌门、脱铁杆菌门、变形菌门和TM7菌门组成比例和上调厚壁菌门、柔膜菌门和疣微菌门比例;能够上调Akkermansia muciniphila的组成比例,并下调Alistipes indistinctus和Mucispirillum schaedleri的组成比例。因此,推断开菲尔能够调节高脂饲料引起的肠道菌群失调,抑制体质量增加和降低血脂指标。

几种高脂血症动物模型的比较

为建立更合理而实用的高脂血症动物模型 ,比较了SD大鼠、Wistar大鼠和金黄地鼠的血清和肝脏脂质对高脂饲料的反应。大鼠高脂饲料配方为 1%胆固醇、10 %猪油、10 %蛋黄粉和 79%基础饲料 ;金黄地鼠高脂饲料配方为 0 2 %胆固醇、15 %猪油和 85 %基础饲料。结果显示 ,经过高脂饲料喂养 5周后 ,SD大鼠、Wistar大鼠和金黄地鼠高脂组血清甘油三酯水平分别比对照组高 194 4 %、86 2 %和 84 3 % (P <0 0 5 ) ,血清总胆固醇水平分别比对照组高 76 8%、4 8 3 %和 13 4 8% (P <0 0 5 )。提示金黄地鼠是一种良好的高胆固醇血症模型 ,而SD大鼠可能是一种较好的高甘油三酯血症模型。

膳食鱼油对高脂血症金黄地鼠血脂水平的影响

目的研究膳食鱼油对高脂血症金黄地鼠血脂水平的影响。方法建立高脂血症金黄地鼠动物模型,分别予以不同量的鱼油(A组为对照组,B、C、D组分别给予0.5、0.8、1.2ml/d鱼油)喂饲以观察其对血脂水平的影响。结果C、D两组甘油三酯水平比对照组明显降低(P<0.01和P<0.05);C组较B组下降更明显而且两组间差异有显著性(P<0.05)。胆固醇及高密度脂蛋白水平,各组间差异均无显著性(P>0.05)。结论膳食鱼油具有降低血甘油三酯作用,其中以进食中等量鱼油组效果最佳;但未见其具有降低胆固醇及升高高密度脂蛋白的作用。

表达IFNα2b-HSA融合蛋白的CHO细胞培养基优化及发酵放大

毕赤酵母表达的干扰素与白蛋白融合蛋白虽然避开了干扰素单体半衰期短的缺陷,但毕赤酵母对药物的糖基化修饰与人体的糖基化修饰差异性导致了药物的毒副作用。目前药物在CHO系统的表达得到了广泛应用。本研究室首次构建了能表达干扰素α2b和人血清白蛋白融合蛋白（IFNα2b-HSA）的CHO细胞株。在此基础上,本研究通过对12种国产商业化基础无血清培养基和5种流加培养基进行优化筛选,获得最适培养方案：基础培养基选择最适于生长的5号培养基（M2∶M4=1∶1）,流加培养基选择最有适于表达的F4培养基。在此基础上,进行5L生物反应器的发酵放大,pH为6.9-7.4,DO为40%-60%,细胞密度达到7.0×106cells/mL时,温度由37℃降温至34℃,细胞活率降至80%时停止发酵,最终融合蛋白表达量达到137mg/L。初步实现了IFNα2b-HSA融合蛋白在CHO细胞中的高密度发酵。

牛血清在百日咳毒素CHO细胞簇聚试验中的影响

目的观察不同胎牛血清对百日咳毒素在中华仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell,CHO）细胞簇聚试验中的影响。方法分别用两个厂家共6批次的牛血清培养CHO细胞,连续传3代后进行细胞簇聚试验,观察添加PT阳性对照、纯化PT、脱毒PT后其细胞的簇聚效果。结果 1、2号牛血清培养的CHO细胞生长缓慢,3-6号牛血清培养的CHO细胞生长正常。质量浓度16 ng/m L的PT阳性对照和纯化PT均未引起1-2号CHO细胞簇聚;3-6号牛血清培养的CHO细胞PT阳性对照判定终点分别为2、1、16、4 ng/m L,其纯化PT判定终点分别为1、0.5、8、2 ng/m L;脱毒PT质量浓度为40μg/m L时,1、2、5号牛血清培养的CHO不簇聚,而3、4、6号牛血清培养的CHO细胞脱毒PT判定终点分别为10、5、20μg/m L。结论 6种牛血清培养的CHO细胞簇聚程度存在差异,其中以4号牛血清培养的CHO细胞对PT阳性对照、纯化PT和脱毒PT最为敏感。需筛选对簇聚试验敏感度高的牛血清用于百日咳毒素CHO细胞簇集试验。

中华仓鼠卵巢(CHO)工程细胞无血清培养的研究

以DMEM∶F12(1∶1)为基础培养基,通过观察细胞生长状态和检测乙肝表面抗原的表达量作为评价指标,筛选适合于CHO工程细胞生长的生长因子,如胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松、硒酸钠,丁二胺等。并且建立了J5SFM培养基。该培养基与商品化的无血清培养基比较,能够使细胞生长维持较长的时间,表达产物分泌量也相对较高。

地鼠血清培养异合卵制备人精子染色体的研究

本文首次应用地鼠血清培养异合卵制备人精子染色体标本，获得显著的效果。同时应用胎牛血精进行了比较，在两种血清中精子染色体形成率分别为１０２．４５％和５８．２８％，可供分析核型获得率分别为７６．１５％和３１．５１％，两组间存在非常显著的差异（Ｐ＜０．００１）．观察分析了６例供精者的４９８个精子核型，数目异常和结构异常发生率分别为０．８％和２．８％。本研究提示地鼠血清培养同种属卵，可促进卵细胞在体外的进一步成熟，并有助于人精原核的发育及其染色体的形成。

中国仓鼠卵巢细胞及其表达载体的改造

哺乳动物细胞因其表达的外源蛋白最接近天然构象,已成为生产重组蛋白药物的理想系统。其中,中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是目前最为常用的表达系统,但这种系统也存在很多缺点,如大规模培养中表达量低、生产成本高、细胞无限度增殖及细胞凋亡等。目前,通过优化培养基配方和培养条件很难从根本上解决上述问题,必须从整个表达系统着手进行改造,其中CHO细胞本身和表达载体的改造最为关键。

王浆主蛋白作为胎牛血清替代物培养中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1的效果及作用机制

用王浆主蛋白(major royal jelly proteins,MRJPs)部分代替胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)培养中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO-K1),比较添加不同MRJPs/FBS(M/F)比例的培养基对细胞相对增殖率的影响。四唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)结果显示:当M/F比例为50/50时对细胞的促增殖作用最显著;与完全培养基对照组(M/F 0/100)相比,培养48与72 h时的相对活细胞数分别上升了25.1%和13.6%。细胞成像仪分析表明,M/F 50/50培养基的细胞密度最高,其细胞直径显著大于完全培养基对照组。流式细胞仪结果显示,与完全培养基对照组相比,M/F 50/50培养基中的细胞增殖指数(proliferation index,PI)提高了19.4%,推测MRJPs的促细胞增殖作用可能与DNA、蛋白质及酶的合成有关。拉曼光谱检测结果显示,各处理组培养基的细胞光谱图之间没有显著差异,说明MRJPs在促进细胞增殖的同时维持了细胞的稳定性。以上结果证明,MRJPs可以部分替代FBS培养生物医药产业中应用广泛的CHO-K1细胞,降低细胞培养成本,具有产业化前景,并为蜂王浆深加工提供新的用途。

人血清白蛋白-白介素-2融合蛋白在CHO细胞中的表达

白细胞介素-2在人体免疫应答中具有重要作用,常用于治疗肿瘤、肝炎和免疫缺陷性疾病等多种疾病,但因其体内半衰期短而限制了其临床应用。文中构建了含有融合蛋白基因HSA-IL-2的p MH3质粒,并通过电转染的方法转入中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO细胞)中,利用p MH3质粒所携带的neo基因进行筛选,经96孔板培养并筛选得到稳定表达目的蛋白质的重组细胞,融合蛋白HSA-IL-2表达量达到2.26 mg/L。利用反转录PCR和Western blot对重组细胞鉴定后发现,融合蛋白编码基因整合入重组CHO细胞基因组中,而且融合蛋白同时具有HSA和IL-2双重免疫原性。利用对IL-2具有依赖性的CTLL-2细胞进行活性分析后发现,筛选得到的表达细胞分泌得到的融合蛋白具有较高的生物活性,表明成功构建具有表达IL-2生物活性能力的CHO细胞。

橙皮素对高脂血症仓鼠的降脂作用和肝脂肪变性的影响

目的:探讨橙皮素(HES)对高脂血症仓鼠的降脂作用、肝脂肪变性的影响及机制。方法:将18只雄性仓鼠均分为正常对照组(NC组)、高脂血症模型组(Model组)及HES干预组(HES组),NC组喂饲基础饲料、另2组喂饲高脂饲料,HES组仓鼠每日按照100 mg/kg剂量给予HES灌胃,其余2组仓鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠灌胃处理,连续6周;于实验开始、实验第3周及第6周取血,测定3组仓鼠血清血脂四项[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)]水平;于实验第6周检测3组仓鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性,检测仓鼠肝脏组织中TC、TG、总抗氧化能力(TAC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平及胆固醇调节元件结合蛋白2(Srebp 2)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)mRNA表达水平,采用HE染色观察各组仓鼠肝脂肪变性程度。结果:与NC组比较,Model组仓鼠第3周及第6周末血清中TC、TG、LDL-C水平明显升高(P<0.05);实验第6周末,Model组血清中ALT、AST活性升高,肝脏中TC、TG、MDA含量及Srebp2、HMGCR的mRNA表达水平升高,TAC、SOD水平下降,差异有统计学意义(P<0.05);与Model组比较,HES组第3周和第6周血清中TC、TG、LDL-C水平下降(P<0.05),实验第6周,HES组血清中ALT、AST活性下降,肝脏中TC、TG、MDA含量及Srebp2、HMGCR的mRNA表达水平下降,TAC、SOD水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);实验第6周,HE染色显示,Model组仓鼠肝细胞体积明显增大且大小不一,可见大小不等的圆形空泡,肝小叶结构模糊不清,HES组仓鼠肝细胞圆形空泡数量及面积明显减少,可见较为清晰的肝小叶结构。结论:HES能有降低血脂水平,减轻高脂血症仓鼠肝脂肪变性,其护肝机制可能与其降脂和抗氧化活性有关。

产HBsAg CHO细胞无血清培养研究

在分析CHO C2 8细胞对培养基中氨基酸利用的基础上 ,对DMEM培养基进行初步优化。再采用统计学正交分析方法 ,在初步优化的DMEM培养基中添加胰岛素、转铁蛋白等促细胞生长因子 ,建立了一种适于CHO C2 8细胞持续用无血清培养基———CHO C2 8 SFM。经转瓶维持实验 ,在CHO C2 8 SFM中维持培养的细胞 ,其乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)表达水平达到用含 5 %FBS培养液维持的 70 %～ 80 % ,但纯化收率提高 1 0 %以上 。

分泌抗甲肝病毒基因工程单抗的rCHO细胞无血清培养研究

在分析antiHAVIgGCHO细胞对筛选的培养基中氨基酸利用的基础上,对基础培养基进行初步优化。再采用统计学正交分析方法,在初步优化的基础培养基中添加胰岛素、转铁蛋白等促细胞生长因子,研制了一种适于分泌抗甲肝病毒基因工程单抗的rCHO细胞悬浮生长用无血清培养基,经Spinner转瓶实验,细胞生长和抗体表达与进口同类产品相当,且成本低廉,可用于大规模悬浮培养。

甲状旁腺激素-人血清白蛋白融合蛋白在CHO细胞中的表达

人甲状旁腺激素是由人甲状腺旁腺主细胞分泌合成的一种单链多肽激素,成熟的甲状旁腺激素含84个氨基酸残基,其活性区域为N-末端1-34氨基酸片段,目前已上市的PTH药物也以34个氨基酸残基的多肽为主,主要用于治疗老年骨质疏松以及绝经后妇女骨质疏松。但是PTH的稳定性较差,导致体内半衰期短,难以形成有治疗作用的稳态血药浓度,从而限制了其临床应用。因此,设计稳定并能保持原有生物活性的PTH药物分子至关重要。构建含有融合蛋白基因PTH-HSA的p MH3质粒,并通过电转染的方法转入中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO细胞)中,利用p MH3质粒所携带的NEO基因进行筛选,最终得到能稳定表达目的蛋白的重组细胞,并在5L发酵罐中进行表达,融合蛋白PTH-HSA表达量达到155mg/L。Western blot检测显示,该融合蛋白同时具有HSA和PTH双重免疫原性。

不同抗原和佐剂对超免疫马匹抗狂犬病血清免疫效价的影响

用羊脑狂犬病疫苗和地鼠肾狂犬病疫苗，加福氏不完全佐剂或AI（OH）3佐剂，对60匹马进行超免后，检测血清中和抗体，结果表明，羊脑狂犬病疫苗的中和抗体滴度（5726．95±2．365～10028．77±1．559，n=38）显著高于地鼠肾狂犬病疫苗（728．50±2．558～2265.75±1．554，n=32）（p＜0．01）。以羊脑狂犬病疫苗作为抗原，加福氏不完全佐剂，血清中和抗体滴度（5726．9±2．365～10028．27±1．259，n=56）明显高于以1％Al（OH）3为佐剂者（655.39±1．357～5369．7±1.606n=60）（P＜0.01）．加福氏不完全佐剂，羊脑疫苗抗原用量减少1/2，而血清中和抗体滴度仍可达到较高的水平。

CHO细胞法检测百日咳毒素毒性的影响因素

目的考察不同培养基、不同牛血清、血清灭活与否及生产过程中添加的各外源物质对百日咳毒素(pertussis toxin, PT)在中华仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell, CHO)簇集试验中的影响。方法分别使用3种培养基F-12K、DMEM/F12和1640培养CHO细胞,并进行CHO细胞簇集试验,观察细胞生长状态及PT引起细胞簇集的敏感性;分别选取2个厂家的牛血清(对2种血清进行灭活和不灭活处理)培养CHO细胞,观察4种牛血清对细胞生长及簇集的影响;选用生产过程中添加的物质进行CHO细胞簇集试验,观察细胞生长状态及是否出现簇集,确定不影响细胞生长的最高浓度,同时使用不影响细胞生长的各添加物质最高浓度进行小鼠组胺致敏试验,观察与CHO细胞簇集试验结果是否一致。结果 3种培养基对CHO细胞生长及CHO细胞簇集存在明显差异,F-12K培养基培养的细胞形态规则、典型,其他2种培养基培养的细胞生长缓慢,且对PT的敏感性均低于F-12K培养基;4种牛血清中胎牛血清培养的细胞生长最快且形态规则,簇集试验敏感性优于其他3组血清;添加的各外源物质均会导致细胞生长缓慢或死亡,在稀释至一定浓度后可以排除添加物质对CHO细胞簇集试验的影响,同时在小鼠组胺致敏试验中不会引起动物死亡。结论 F-12K培养基最适宜实验室CHO细胞生长,不同血清对细胞生长和簇集的敏感度有一定差异,添加的外源物质残留量应进行控制以保证试验结果的稳定可靠。

CHO工程细胞(11G-S)悬浮培养的无血清培养基的设计

以悬浮适应的表达重组尿激酶原(Pro-urokinase,pro-UK)CHO工程细胞系11G-S为对象,采用Plackett-Burman实验设计及响应面分析法,设计支持CHO工程细胞(11G-S)悬浮生长的无血清培养基。以细胞密度为评价指标,在单因素实验的基础上采用Plackett-Burman实验设计对影响细胞生长的培养基添加成分进行考察,确定了3种对细胞生长明显促进作用的培养基添加成分:胰岛素、转铁蛋白及腐胺。继而利用响应面法分析了这3种添加成分的最佳水平范围,设计了一种适用于CHO工程细胞(11G-S)悬浮培养的无血清培养基SFM-CHO-S。11G-S细胞在SFM-CHO-S批次悬浮培养的细胞最大生长密度达到4.12×106cells/mL,pro-UK的最大累积活性达到5614IU/mL,培养效果优于商品化的同类无血清培养基。

葡萄离体培养中胚状体发生的研究Ⅰ.胚状体发生的组织细胞学观察

以葡萄（ＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａＬ．）的花药和花丝为实验材料，观察了葡萄离体培养中胚状体的发生发育过程．结果表明：（１）葡萄的花药和花丝经诱导都可形成胚性和非胚性两类不同的愈伤组织，与外植体来源无关，胚状体经胚性愈伤组织产生．（２）胚状体多起源于胚性愈伤组织表层或表层以下的单个细胞，这些细胞核大，细胞质浓，染色深，在表层者易于脱落而处于单个离散状态，它们的第一次分裂有均等分裂，也有不等分裂，经２细胞、３细胞、多细胞原胚等阶段发育为成熟的胚状体．

生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a的CHO细胞工艺的建立

目的建立生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a(IFNβ1a)的CHO细胞的工艺,探讨CHO细胞表达分泌IFNβ1a的反应动力学规律。方法应用15 L生物反应器悬浮微载体方式培养CHO工程细胞,比较不同时期细胞的生长形态、数量、生物活性、灌流量、葡萄糖消耗量及其他物理参数的变化规律。结果 15 L生物反应器中在初始pH 6.86～7.20,溶氧30%～70%,温度36.8～37.2℃,微载体4 g/L,罐流量6.5 L/h的条件下连续培养40 d,CHO工程细胞的密度维持在5×105个/ml之间,收获的细胞液中重组人IFNβ1a的生物活性为2.5×104～4.0×105IU/ml,葡萄糖消耗量在0.5～2.5 mg/ml之间。结论初步建立了15 L生物反应器培养分泌重组人IFNβ1a的CHO细胞的工艺,为进一步建立工业化生产工艺奠定了基础。