室间隔缺损与HAND2基因罕见变异的关联分析

目的对室间隔缺损(ventricular septal defect,VSD)与HAND2基因启动子区罕见变异的关联性进行分析,并对相关分子机制进行初步探索。方法收集349例VSD组患儿和345例健康对照组儿童血液样本,通过聚合酶链反应扩增目的片段并进行测序,确定HAND2基因启动子区的罕见变异位点。使用双荧光素酶检测进行变异位点功能分析,并通过电泳迁移率变动分析进行分子机制研究,同时使用TRANSFAC和JASPAR数据库预测转录因子。结果通过测序发现3个变异位点(g.173530852A>G、g.173531173A>G和g.173531213C>G)只出现在10例VSD患儿的HAND2基因启动子上,其中4例患儿仅有1个变异位点。双荧光素酶检测显示g.173531213C>G降低了HAND2基因启动子转录活性。电泳迁移率变动分析和转录因子预测提示g.173531213C>G产生了1个转录因子结合位点。结论HAND2基因启动子区的罕见变异g.173531213C>G可能通过影响转录因子的结合,进而参与VSD的发生发展。

利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼Hand2基因敲除模型

心脏神经脊衍生物表达转录因子2(Hand2)是bHLH家族的成员,也称为dHand、Hed和Thing2,可在人以及鼠、鸡、斑马鱼、果蝇等模式动物中表达。国内外的研究显示,Hand2主要影响右心室的发育,在维持右心室祖细胞和右心室形态发生中起关键作用。为了进一步研究Hand2基因参与心脏发育的作用机制,拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼Hand2基因敲除品系。根据生物信息学网站的分析筛选出最优的两个靶位点,设计并合成引物,利用PCR扩增得到Hand2基因sgRNA的cDNA,再转录为mRNA,将两个靶位点sgRNA的mRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎的Ⅰ-细胞期。在斑马鱼的胚胎和成鱼时期进行基因敲除的有效性检测,发现在靶位点附近有碱基的缺失和插入,表明CRISPR/Cas9对斑马鱼Hand2基因敲除是有效的。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了斑马鱼的Hand2基因敲除模型,为后期研究Hand2基因在人类疾病中的作用机制和新型治疗靶点的临床开发等奠定了基础。