杭白菊总黄酮的舒血管作用

目的观察杭白菊总黄酮(TFCM)的舒血管作用并探讨其作用机制。方法大鼠胸主动脉环张力测定法。结果在内皮完整及去内皮血管上,TFCM均浓度依赖性地降低苯肾上腺素(PE)预收缩血管的张力,拮抗高钾引起的血管收缩;TFCM使PE收缩曲线非平行右移,且使最大张力减小;L-NAME、亚甲蓝和吲哚美辛能显著减弱TFCM的血管舒张作用;TFCM可以显著对抗无钙环境下以及无钙环境下渐加钙由PE引起的血管收缩。结论TFCM对血管的舒张作用表现为内皮依赖性,其舒张作用与其直接抑制电压依从性钙通道、受体操纵性钙通道、细胞内钙释放有关。

不同加工方法对杭白菊质量的影响

本文研究了不同加工方法对杭白菊外观色泽及有效成分的影响。结果表明,从外观色泽及水溶性浸出物比较,传统的蒸晒法最好;以氨基氮、挥发油及木犀草素含量比较,则生晒法>阴干法>蒸晒法。蒸晒法对药用指标成分挥发油和木犀草素含量损失很大,仅为生晒法的45%和65.7%。

基于UPLC-Q-TOF-MS和多元统计分析的杭白菊道地性研究

目的:鉴定不同产区胎菊、朵菊的主要差异化学成分,为杭白菊的道地性研究提供依据。方法:收集不同产区的杭白菊胎菊和朵菊样品,采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF-MS)进行化学成分分析,综合运用数据非依赖扫描(DIA)与数据依赖扫描(DDA),结合本地及在线数据库,鉴定主要化学成分。应用正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)等多元统计分析方法,对胎菊与朵菊、不同产区胎菊与朵菊、道地产区(桐乡)与非道地产区胎菊与朵菊进行模式分类,以分析过程中变量重要性投影(VIP)值、t检验筛选出主要的差异化合物。结果:从供试样品中共鉴定出33个化合物。胎菊与朵菊化学轮廓差异明显,D-甘露糖、羟基芫花素、槲皮素等为主要的差异化合物;不同产区胎菊化学轮廓差异较明显,其中桐乡胎菊中鸟苷、姜糖酯B等成分含量显著高于其他产区,可作为鉴定道地产区的标志性成分;不同产区朵菊的差异相对较小,但浙江和其他省份(江苏、河南)产朵菊有一定差别,红车轴草素-7-O-β-D-葡萄糖苷为主要的差异化合物。结论:不同产区胎菊的差异较大,而朵菊的差异较小,可能的原因为杭白菊成熟后,化学成分的含量趋于稳定。

不同产地杭白菊中绿原酸、木樨草苷、异绿原酸含量分析

目的:检测不同产地杭白菊中绿原酸、木樨草苷、异绿原酸的含量。方法:采用高效液相色谱仪进行检测。色谱条件:色谱柱为Merk Purosher RP-18 e(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液;流速为0.8mL/min;柱温30℃;检测波长为348 nm;进样量为10μL。结果:绿原酸在0.016~0.48μg范围内线性关系良好,木樨草苷在0.0125~0.375μg范围内线性关系良好,异绿原酸在0.042~1.26μg范围内线性关系良好,平均加样回收率为99%,RSD小于3%。10批菊花药材中,9号样品绿原酸含量未达到《中国药典》2020版一部要求(≥0.2%),10号样品质量最好,其次是8号,其他样品质量相近。结论:目前市售杭白菊质量参差不齐,应加强杭白菊药材的质量监测。

3种规格菊花有效成分与重金属元素的质量评价研究

目的:以绿原酸(C)、木犀草苷(L)、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸(D)3种有效成分的含量和铅(Pb)、镉(Cd)、砷(As)、汞(Hg)、铜(Cu)5种重金属元素的含量综合评价3种菊花(杭菊、贡菊、胎菊)的质量,并研究二者之间的相关性。方法:从浙江、安徽收集33份杭菊、16份贡菊、10份胎菊样品,建立测定这3种有效成分含量的HPLC法和5种重金属含量的ICP-MS法,测定其含量,运用单因素方差分析法、主成分分析法比较3种规格菊花的差异,并结合多元相关性分析法研究这3种有效成分与5种重金属之间的相关性。结果:杭菊与贡菊的C、D含量差异,杭菊与胎菊之间的C含量差异,贡菊和胎菊之间的D含量差异均有统计学意义(P<0.05)。主成分分析的综合得分值贡菊(0.006,8,n=16)>胎菊(0.006,0,n=10)>杭菊(0.005,1,n=33)。杭菊和贡菊的Pb、Cu、Hg含量差异,杭菊和胎菊之间的Pb、Cu含量差异均有统计学意义(P<0.05)。主成分分析的综合得分值杭菊(1.747,9,n=33)>贡菊(0.516,6,n=16)>胎菊(0.196,0,n=10)。多元相关性分析表明,L与Pb成负相关,表达式为L=-0.264Pb+0.003;D与Pb成负相关、与Hg成正相关,表达式为D=-0.260Pb+0.394Hg+0.009;其余之间均无相关性。结论:建立测定3种规格菊花中3种有效成分含量的HPLC法和5种重金属元素含量的ICP-MS方法准确、可靠、重现性好。以药效的角度而言,贡菊的质量最优,其次是胎菊,杭菊最差。以安全性的角度考虑,胎菊的安全性最高,其次是贡菊,杭菊最低。二者存在一定的相关性。

硫磺熏蒸对杭白菊化学品质的影响

该文采用HPLC对硫熏前后杭白菊中的8种化学成分进行定量比较,发现硫熏前后的杭白菊化学组成有较明显的差异,黄酮苷类及奎宁酸类成分的含量降低,而黄酮苷元的含量升高,酚酸类成分含量降低,进一步采用SMCA P+11.0软件对硫熏前后的杭白菊进行主成分分析(PCA)及偏最小二乘聚类判别模式分析(PLS-DA);PCA分析结果显示,6批杭白菊样品分别聚成2组,分别为杭白菊热风干燥组和硫熏组;通过PLS-DA分析提取出对硫熏前后杭白菊分组贡献率大于1(VIP>1)的3个成分,分别为木犀草素,芹菜素,木犀草苷;同时采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)与电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)相结合对硫熏前后杭白菊中硫,锰,铁,铜,铅4种元素进行测定。结果表明,硫磺熏蒸后杭白菊中S含量显著高于未熏组(P<0.05)。研究发现,硫磺熏蒸使杭白菊中的化学成分发生改变,硫残留量增加,因此,认为硫磺熏蒸对杭白菊的化学品质具有一定程度的负面影响。化学成分定量分析与多元统计分析相结合的方法,可快速、直观地分析硫熏前后杭白菊化学成分的变化情况,研究结果为规范杭白菊的加工工艺及其质量控制提供参考。

不同产地杭菊植物学特征比较

目的:对不同产地杭菊各栽培类型主要植物学性状进行比较,以期为杭菊规范化引种栽培提供依据。方法:测定不同产地杭菊植株、叶片及头状花序特征进行分析比较。结果:不同产地杭菊植株高度范围为60.87～99.47 cm,分枝数为2.76～5.20;叶长为4.90～8.40 cm;叶宽为3.25～5.38 cm;叶片长宽比为1.35～1.83;叶裂数为1.92～3.08。头状花序数为21.92～53.12;直径为3.41～5.48 cm;舌状花层数为3.28～7.16;舌状花瓣数为55.32～114.60;舌状花瓣长为1.58～2.37cm;瓣宽为0.50～0.69 cm;瓣长宽比为2.90～3.99;管状花直径为1.10～1.58 cm。结论:不同产地杭菊植物学性状差异显著,随着引种栽培环境的改变,杭菊植物学性状发生了一定的改变。

杭菊品种及产地现状考察

目的:对杭菊不同产地及所产品种现状进行考察,了解全国杭菊资源历史和现状。方法:实地调查、标本和文献研究。结果:杭菊道地产区一直位于杭嘉湖平原,现形成以浙江桐乡为道地,江苏射阳和湖北麻城为引种产区的新格局,分别主产湖菊、小白菊、大白菊,而杭黄菊仅产于江苏射阳。其中桐乡和射阳出现杭菊新兴加工品胎菊,引种产区均出现早菊。结论:由于长期人工栽培和选育,杭菊产生了多样品种、其习性各异,适应不同产地环境。

杭菊DFR基因克隆及其在花中表达特征分析

目的克隆杭菊Chrysanthemum morifolium二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)基因,并研究其在花芽分化期及开花期不同时期的表达特征。方法根据已报道的菊花Chrysanthemum morifolium DFR基因序列设计引物,通过荧光定量PCR(RT-PCR)技术从杭菊头状花序中扩增出目的基因片段,连接、转化、挑取阳性克隆测序并拼接;采用基于内参基因的相对定量PCR方法,分析该基因表达量特征。结果得到全长1 152 bp的杭菊DFR基因,最大开放阅读框1 029 bp,共编码342个氨基酸。NCBI上进行Blast比对,该基因与其他植物的DFR基因有很高的同源性。RT-PCR表明该基因在花芽分化时期不同阶段以及开花期不同时期花不同部位中表达量均有差异。花芽分化时期杭菊DFR基因在50 d表达量最高;开花期该基因在时期I的管状花中表达量最高,在时期II的花序托中表达量最低。结论克隆得到杭菊DFR基因c DNA序列,该基因表达存在时间和空间上的差异,表达量在花蕾膨大成熟到舌状花开放30%的时间段内最高。该结果为进一步进行该基因在杭菊中的表达与催化产物的关系和调控机制研究奠定了基础。

滁菊的HPLC指纹图谱制作及其化学计量学分析

建立滁菊的HPLC指纹图谱,结合化学计量学手段对不同滁菊的指纹图谱进行分析研究,以期为滁菊的质量控制和产地追溯提供依据。采用HPLC法建立指纹图谱,并用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)和系统聚类、主成分分析2种化学计量学法对指纹图谱和特征峰进行分析。分析结果发现样品有27个共有峰,12个滁菊样品具有较高的相似度,杭菊与滁菊的相似度较差,聚类分析与主成分分析结果和相似度分析结果一致。将HPLC指纹图谱与化学计量学结合可对滁菊进行鉴别和质量评价,为其质量控制和追溯提供了理论参考。

淹水胁迫对杭菊花色苷及合成相关酶和基因的影响

测定不同开放程度杭菊头状花序花色苷含量及其相关基因表达量和相关酶活性和含量,分析淹水胁迫对杭菊头状花序开放过程中花色苷合成的影响。结果发现杭菊CHS基因表达量和CHS酶含量随杭菊头状花序开放程度的增加呈现先上升后下降的趋势,而花色苷含量、DFR基因表达量和DFR酶活性均随杭菊头状花序开放程度的增加而呈现先下降后上升的趋势,花色苷与DFR基因和DFR酶呈显著正相关,而与CHS基因和CHS酶无显著相关性。说明淹水胁迫对杭菊花色苷的合成及其相关酶和基因有显著影响,但不改变它们在杭菊头状花序开放过程中的变化规律,DFR基因和DFR酶的变化规律与花色苷一致,确实为花色苷合成的关键基因和关键酶,而CHS基因和CHS酶含量与花色苷的含量无显著相关性,CHS基因和CHS酶是否为杭菊花色苷合成关键基因和关键酶还有待进一步研究。

中药菊花基原特征成分的分析

目的:建立菊花药材中6种化合物(绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、山柰酚以及金合欢素)的HPLC含量测定方法及其指纹图谱检测方法,并对所收集到的市售5种药用菊花样品利用主成分分析获取能反映不同菊花样本间基原远近的关键成分。方法:含量测定部分采用YMC-Park ODS-AQ C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.01%磷酸为流动相梯度洗脱,流速0.8 m L·min^(-1),检测波长330 nm,柱温25℃;结合SPSS 16数据分析软件及SIMCA-P主成分分析软件对含量测定的数据进行分析,筛选出对菊花基原判定影响最大的特征成分组。结果:含量测定方法学验证结果良好,并且通过含量测定结果的数据分析,确立了与菊花基原判别最相关的特征成分组为木犀草素及木犀草苷。结论:本研究所建立的含量测定方法可以用于菊花药材中6种成分的定量分析,主成分分析所筛选出的基原远近的决定性成分因子,能大体上将不同来源的菊花样品按基原归类,为市售菊花基原鉴定提供参考依据。

杭菊CHI基因的克隆及原核表达

从杭菊转录组数据库中筛选并通过PCR技术成功克隆得到3条杭菊査尔酮异构酶基因(Cm CHI)分别命名为:CmCHI1,Cm CHI2,Cm CHI3。生物信息学分析表明:Cm CHI1~3开放阅读框的碱基数分别为708,633,681 bp分别编码235,210,226个氨基酸。利用原核表达技术成功诱导得到3条30 k Da左右的融合蛋白,同时使用Ni-NTA树脂柱分离纯化得到相应的重组融合蛋白。聚类分析表明,筛选得到的3条Cm CHI与菊科植物同源性较高,Cm CHI1与Cm CHI3属于Ⅰ型CHI;Cm CHI2属于Ⅳ型CHI。以β-actin为内参基因,使用RT-qPCR检测并分析Cm CHI1~3基因在杭菊中的表达量差异,结果表明Cm CHI1,Cm CHI3表达量较高,Cm CHI2表达量较低;淹水处理能显著促进Cm CHI1,Cm CHI3基因的表达,而对Cm CHI2无调控作用,由此得出CmCHI1,Cm CHI3是主要参与杭菊黄酮类化合物合成的查尔酮异构酶基因,Cm CHI2为辅助基因。以上研究结果为进一步研究CHI基因在杭菊黄酮类化合物代谢中的分子调控机制提供依据,从而为提高杭菊黄酮含量及最终提高杭菊药用品质奠定基础。

杭菊黄酮醇合酶基因的原核表达与重组蛋白体外活性研究

从杭菊转录组数据库中筛选并通过RACE技术克隆出1条黄酮醇合酶基因（暂命名Cm FLS）,简单序列分析表明Cm FLS基因全长1 235 bp,包含1个1 008 bp的开放阅读框（ORF）,编码335个氨基酸。预测得到的Cm FLS编码的蛋白相对分子质量为37.96 k Da,等电点（p I）为5.41,构建进化树发现Cm FLS与菊科其他种植物同源性很高。利用原核表达技术成功诱导出大小43 k Da左右的重组融合蛋白,同时使用Ni-NTA树脂分离纯化出重组融合蛋白,并确定使用含250 mmol·L-1咪唑的Ni-native buffer洗脱效果最好。将纯化后的重组融合蛋白进行体外催化反应,然后将反应的产物萃取后进行HPLC分析,结果显示Cm FLS重组融合蛋白在特定缓冲液及反应条件下能够将二氢槲皮素催化生成槲皮素,表明Cm FLS编码的功能性蛋白在杭菊黄酮生物合成途径中具有双加氧酶活性。以上研究结果为进一步研究Cm FLS的功能、阐明FLS酶的功能机制奠定了基础,同时为从分子水平调控杭菊黄酮醇成分代谢及体外催化合成黄酮醇提供新思路。