溶解氧昼夜变化对鳜血液生理生化指标及血红蛋白基因表达的影响

【目的】探究养殖水体溶解氧昼夜变化下鳜(Siniperca chuatsi)血液生理生化指标及血红蛋白基因(Hb)应答的变化规律,为揭示鱼类的短期低氧适应机制提供理论依据。【方法】以健康的鳜幼鱼为研究对象,通过转录组测序和基因组测序数据匹配,鉴定出鳜Hb基因序列,并进行生物信息学分析。在7:00、11:00、17:00和23:00等4个时间点采集鳜血液样品,使用PROCANPE-6800血细胞分析仪测定红细胞数、血红蛋白含量、红细胞压积、平均红细胞血红蛋白浓度和平均红细胞体积,采用实时荧光定量PCR检测Hb基因的表达变化。【结果】共鉴定获得11个鳜Hb基因,包括6个α型Hb基因(hbae4、hbae、hbae1.1、hbae5、hbaa1和hbaa1.1)及5个β型Hb基因(hbbe2、hbba2.1、hbba1、hbba1.1和hbba2);除hbae4基因序列由6个外显子和5个内含子构成外,其余10个基因序列均由3个外显子和2个内含子构成。11个鳜血红蛋白均不存在跨膜结构和信号肽,亚细胞定位于细胞质,其二级结构由α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲构成。池塘水体溶解氧含量存在周期性的昼夜变化;溶解氧含量最低时(7:00),鳜血液红细胞数、红细胞压积、血红蛋白含量和平均红细胞血红蛋白浓度均最高,显著高于其他3个时间点(P<0.05,下同);溶解氧含量最高时(17:00),红细胞数、红细胞压积和血红蛋白含量则显著低于其他3个时间点;平均红细胞体积在4个时间点无显著变化(P>0.05)。hbae4、hbae、hbae1.1、hbae5、hbaa1.1、hbbe2、hbba2.1、hbba1和hbba2基因的相对表达量均随溶解氧昼夜变化呈先上升后下降趋势,于17:00时达最高值,且这9个Hb基因在4个时间点的表达模式基本一致,即低溶解氧时相对表达量最低,高溶解氧时相对表达量最高;而hbaa1和hbba1.1基因相对表达量与溶解氧含量成反比。【结论】鳜通过调节红细胞数、血红蛋白含量和平均红细胞血红蛋白浓度等机制及调控Hb基因表达,以适应溶解氧的昼夜变化,从而保持机体供氧稳定。

棉花HB红花近等基因系的苗病、枯萎病与黄萎病抗性比较

对回交转育获得的7个遗传背景的HB红花近等基因系以及这7个遗传背景下的39个近等基因姊妹系,在枯萎病与黄萎病混生病圃种植条件下进行了苗病、枯萎病与黄萎病的抗性评价。结果表明,HB红花基因转入陆地棉品种后,不仅对棉花苗病、枯萎病和黄萎病的抗性未带来任何负面影响,而且还在一定程度上提高了棉花的整体抗病水平。比较而言,对提高苗病抗性的效果较为显著,其次是对黄萎病抗性,对枯萎病的抗性几乎没有影响。

P4HB基因真核表达质粒的构建及在人肺腺癌A549细胞中的表达

目的构建人P4HB基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从正常人肝细胞HL7702中扩增P4HB基因片段,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB,在脂质体LipofectamineTM 2000介导下转染A549细胞,通过G418加压筛选,建立稳定转染细胞系,通过qPCR和Western blot法检测转染细胞中P4HB基因mRNA的水平及蛋白的表达水平。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB经双酶切(BamHⅠ/EcoRⅠ)和测序证实构建正确;质粒pcDNA3.1-P4HB转染的A549细胞中P4HB基因mRNA的水平为空载体转染的细胞和未转染细胞的102倍;质粒pcDNA3.1-P4HB转染的A549细胞中P4HB蛋白的表达量(1.71)较未转染的A549细胞(1.11)明显升高。结论成功构建了P4HB基因真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB,转染A549细胞后,P4HB基因在mRNA水平和蛋白水平均出现了较强的表达,表明P4HB基因已稳定转染入A549细胞中。本实验为进一步研究P4HB对人肺癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响奠定了基础。

P4HB基因变异所致成骨不全1例并文献复习

报道首都儿科研究所附属儿童医院诊治的1例P4HB基因变异致成骨不全患儿资料并进行文献复习。本例为女性,6个月龄,因近3个月内反复骨折入院。临床表现为反复骨折、严重骨骼畸形及额头宽大、眼球突出、鼻梁低平等特殊面容。根据临床表现诊断为成骨不全,并采用帕米膦酸二钠输注治疗。予全外显子测序,结果提示患者为P4HB基因c.1178A>G(p.Y393C)杂合错义变异所致科尔·卡彭特综合征1型。文献复习共检索到8例P4HB基因变异所致成骨不全病例,涉及5个变异位点,基因不同位点变异导致临床表现及轻重程度有所不同,提示本病基因型-表型相关性可能与影响编码蛋白不同结构域有关。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2融合HBS基因重组质粒的免疫原性研究

目的 构建恶性疟原虫海南分离株 (FCC1/HN)裂殖子表面蛋白 2 (MSP2 )融合HBsAg基因片断真核重组表达质粒 pVXORF1-PfMSP2 -HBS ,观察该DNA疫苗的免疫特性。方法 (1)以恶性疟原虫海南分离株 (FCC1/HN)基因组为模板 ,扩增出pfMSP2 DNA片断 ,将该片段克隆入质粒pVXORF1-HBS中HBS的上游并与之紧密相连 ,构建质粒 pVXORF1-PfMSP2 -HBS ;构建真核重组表达质粒 pVXORF1-PfMSP2 以作为对照。 (2 )用上述构建的质粒及空质粒 pVXORF1免疫KM小鼠 ,以ELISA检测血清IgG抗体。 结果 (1)筛选出的重组子为编码FCC1/HNMSP2 基因片断的重组质粒 pVXORF1-PfMSP2 -HBS及 pVXORF1-PfMSP2 。 (2 )裸DNA尾根多点注射KM小鼠 ,显示 pVXORF1-PfMSP2 -HBS组小鼠较pVXORF1-PfMSP2 组小鼠产生抗PfMSP2 蛋白的抗体效价明显增高 ,二者比较 ,差异有非常显著意义 (P <0 0 1)。结论 PfMSP2 融合HBsAg基因片段激发机体产生抗PfMSP2 抗体的能力显著增强 ,提示PfMSP2

乙型肝炎病毒HBs、HBx基因与HBVM的相关性及临床意义研究

目的:阐明HB s、HBx基因与HBVM的相关性及临床意义。方法:以HCC s、LC ir、SeCH、CHB以及A SC s作为研究对象,应用EL ISA法检测研究对象血清中HB sA g、HB sA b、HB eA g、HB eA b、HB cA b;应用PCR技术、探针杂交法及免疫化学自显影法定性检测HB s、HBx基因。结果:在研究对象中,HB sA g+HB eA b+HB cA b、HB sA g+HB eA g+HB cA b和HB sA g+HB cA b模式阳性率分别为:53.3%、27.0%和11.8%;除A SC s组外,各临床类型肝病HB sA g+HB eA b+HB cA b模式阳性率均高于HB sA g+HB eA g+HB cA b模式的阳性率,但差别无统计学意义(P>0.05);与A SC s组比较,HCC s组的HBx基因阳性率明显高于A SC s组(P<0.05),其余各组均无明显差别(P>0.05)。与A SC s组比较,LC ir和SeCH组病人中的HB s基因阳性率显著高于A SC s组(P<0.025),其余各组无明显差异(P>0.05);以HB sA g模式作为对照时,各HBVM模式的HB s、HBx基因阳性率与HB sA g模式的阳性率无明显差别(P>0.05);但在HB sA g+HB eA g+HB cA b模式中阳性率显著高于HB sA g+HB eA b+HB cA b模式的阳性率(P<0.001);HB sA g+HB cA b模式中的HBx基因阳性率也显著高于HB sA g+HB eA b+HB cA b模式的阳性率(P<0.001)。结论:HB sA g+HB eA b+HB cA b模式与肝病的发病关系似乎比HB sA g+HB eA g+HB cA b模式更为密切;HBx基因与HCC s的发生存在密切关系,而HB s基因与LC ir、SeCH的发生关系密切。HB s、HBx基因与HB sA g+HB eA g+HB cA b模式关系密切,而HBx基因还与HB sA g+HB cA b模式存在密切关系。

绵羊Hbβ基因座频率分布的研究

采用淀粉凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦检测了在中心产区抽取的滩羊、同羊、小尾寒羊和湖羊 4个群体编码Hbβ基因座上的变异 ,搜集国内外 10个绵羊群体的相同资料 ,对Hbβ基因座频率分布进行分析。研究表明 :淀粉凝胶电泳只能检测出 3种表型 ,等电聚焦可以检测出 6种表型 ;近交是造成湖羊和同羊Hbβ座位遗传不平衡的主要原因 ;在高海拔 ( >3 0 0 0m )地区绵羊HbβA占优势 ,中、低海拔地区的绝大多数绵羊群体HbβB 占优势 ,HbβA 频率或HbβB 频率与海拔之间无线性变化关系。

广西重型β地中海贫血HBS1L-MYB基因多态性与胎儿血红蛋白的相关性研究

目的研究HBS1L-MYB基因rs35959442、rs4895441和rs9399137位点多态性与胎儿血红蛋白(Hb F)的相关性。方法通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性,DNA测序技术检测广西籍64例重型β地中海贫血患者(病例组)及64例健康对照组HBS1L-MYB基因rs35959442、rs4895441和rs9399137位点多态性,并分析它们与Hb F水平的相关性。结果病例组HBS1L-MYB基因rs4895441和rs35959442位点G等位基因频率均明显高于健康对照组(P<0.05),而两组rs9399137位点等位基因频率及基因型分布比较,差异无统计学意义(P>0.05)。rs4895441位点、rs35959442位点与Hb F水平呈正相关关系(P<0.0167),rs9399137位点与Hb F无相关关系(P>0.0167)。结论广西重型地中海贫血HBS1L-MYB基因多态性与Hb F水平有关,rs35959442和rs4895441位点基因突变可能有助于提高Hb F的水平。

牛皮蝇Hypoderm in B基因的克隆及原核表达载体构建

参照牛皮蝇HypoderminB(HB)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以牛皮蝇总RNA为模板利用RT-PCR扩增牛皮蝇HB基因,并对扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,克隆的牛皮蝇HA基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.2%和99.3%。同时,将该基因与原核表达载体PGEX-4T-1连接,构建并获得阳性重组表达载体。

用DNA扩增法检测镰状细胞基因

本文报道应用DNA扩增技术对国内首例镰状细胞特征患者(Hb s杂合子)进行基因诊断。方法是从患者干血标本中微量抽提基因组DNA,通过聚合酶链反应(PCR)扩增其β珠蛋白基因,经限制性内切酶MstⅡ消化后作电泳分析直接检测Hb S基因。本文介绍的DNA诊断技术快速、灵敏、简便,它不需要放射性同位素标记的探针,可以采用干血抽提的DNA,因此,对遗传病基因诊断和携带者的筛查具有重要价值。

重组质粒pSUPER-HBs RNAi的构建及筛选

目的:利用pSUPER-RNAi载体系统进行HBsRNAi序列的初步筛选和干扰效果鉴定。方法:设计并合成针对HBs基因区的3条siRNA(HBs-siRNA1、HBs-siRNA2、HBs-siRNA3),构建3种重组载体pSUPER-HBs-siRNA,与HBV质粒同时瞬转人胚肾293T细胞,72h后观察转染效果,实时定量PCR和ELISA法鉴定3种干扰序列对HBs的干扰效果,筛选最佳干扰序列。结果:成功构建3种干扰质粒pSUPER-HBs-siRNA,能高效转染人胚肾上皮细胞293T,转染效率在70%以上;实时定量PCR和ELISA法结果均显示HBs-siRNA2可有效抑制HBs的表达,抵制率可达80%,而HBs-siR-NA1、HBs-siRNA3干扰效果不显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建3种干扰质粒pSUPER-HBs-siR-NA,筛选出其中能有效抑制HBs基因表达的pSUPER-HBs-siRNA2序列,为后续研究奠定了基础。

重组腺病毒载体介导共刺激分子B7.1基因对儿童肝母细胞瘤体外淋巴细胞增值的影响

目的研究含hB7-1基因的重组腺病毒载体对儿童肝母细胞瘤体外淋巴细胞增值的影响。方法以腺病毒为载体,将hB7-1基因转入HepG2细胞,以FCM检测HepG2和HepG2/hB7-1细胞表面B7-1分子的表达情况。观察HepG2和HepG2/hB7-1细胞的生长曲线。用混合淋巴细胞培养法检测瘤苗对T淋巴细胞增殖的影响。结果HepG2细胞表面B7-1分子表达水平低,其阳性率为1.1%。而HepG2/hB7-1的B7-1分子表达阳性率达到18.5%,B7-1基因的表达水平提高16.8倍。HepG2和HepG2/BB-102的生长曲线相比,后者生长曲线上升减缓,生长速度减慢。B7-1分子的表达促进了淋巴细胞的增殖,较对照组有显著性差异(P<0.05)。结论1.HepG2表面B7-1分子低水平表达是其弱免疫原性的主要原因。2.含hB7-1基因的重组腺病毒载体转染HepG2可以获得B7-1分子高表达的细胞株。3.重组腺病毒载体的转染可以降低肝母细胞瘤细胞的恶性表征。4.转染含hB7-1基因的瘤苗可以促进T淋巴细胞的增殖。

hB7-1基因转染对人卵巢癌SKOV3细胞生物学特性及MHC Ib与HLA-DR抗原表达的影响

目的研究hB7-1基因转染对人卵巢癌SKOV3细胞生物学特性及MHCIb和HLA-DR抗原表达的影响。方法以腺病毒为载体将hB7-1基因转染SKOV3细胞,噻唑蓝还原法检测SKOV3细胞生长曲线;流式细胞技术观察转染前后细胞周期改变以及hB7-1、MHCIb、HLA-DR分子表达;电镜观察细胞形态学变化。结果hB7-1基因转染人卵巢癌SKOV3细胞前后细胞生长曲线无明显差异(P>0.05);SKOV3细胞感染病毒48h后在相同条件下形态上较感染前无明显改变;hB7-1基因转染48h后,SKOV3细胞表面MHCIb、HLA-DR抗原表达较转染前分别增高1.10±0.22和1.03±0.17,80%细胞表面有较高水平hB7-1基因表达,差异显著(P<0.05)。结论hB7-1基因转染人卵巢癌SKOV3细胞后对细胞生长能力、细胞周期、细胞超微结构变化等生物学特性无明显影响,可显著增强人卵巢癌SKOV3细胞表面的MHCIb和HLA-DR抗原表达,为实现卵巢癌基因治疗提供理论基础。

1例异常血红蛋白合并东南亚缺失型地中海贫血的报道

目的报道我国首例异常血红蛋白合并东南亚缺失型地中海贫血的病例1例。方法在产前筛查中发现1例血红蛋白分析异常峰,即运用西森美康XN 1000进行血细胞分析、高效液相色谱法进行血红蛋白组分分析、采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)结合反向点杂交技术诊断及跨越断裂点的聚合酶链反应技术进行地中海贫血基因型分析、运用基因测序对异常血红蛋白突变位点进行测序。结果红细胞计数为7.29×1012/L,血红蛋白浓度为148.0 g/L,红细胞平均体积60.62 fL,红细胞平均血红蛋白量为20.32 pg;高效液相色谱法分析血红蛋白组分结果为血红蛋白A20.5%,血红蛋白F 0.2%,血红蛋白A 41.9%,D窗发现异常血红蛋白变异体46.1%;地贫基因型为东南亚缺失型地中海贫血;异常血红蛋白基因测序显示该患者α2基因的第75个密码子发生突变,有天冬氨酸变为天冬酰胺,即HbMatsue-Oki。结论该异常血红蛋白HbMatsue-Oki病例为我国首例发现并报道,其合并东南亚缺失型地中海贫血时未加重原有的表型。