重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性。方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实,目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)为36 000;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为9.4×104IU/mg。结论:获得了可溶性的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,且其纤溶活性与尿激酶标准品相当。为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。

水稻OsC2HC-1锌指蛋白基因的表达分析及对盐碱逆境的响应

迄今,已从水稻中发现多种参与非生物胁迫反应的锌指蛋白基因,多为C2H2型,对于水稻C2HC型锌指蛋白基因的研究少有报道。本研究用RT-PCR技术从日本晴cDNA中克隆已知基因(AK103785)全长1019bp,编码339个氨基酸。经BLAST比对,确定其含有一个C2HC型锌指结构域,命名为OsC2HC-1,将OsC2HC-1::GFP融合导入酵母细胞和洋葱表皮细胞,亚细胞定位表明OsC2HC-1在细胞核中。实时荧光定量PCR检测80mmol/LNaCl,30mmol/LNaHCO3胁迫处理水稻叶和根中OsC2HC-1基因转录表达受其诱导显著增加。小量诱导优化pGEX-6p-3::OsC2HC-1在宿主菌BL21(DE3)中原核蛋白表达条件,表明诱导时间4h,28℃为最优条件,融合蛋白大量诱导纯化得到以包涵体的形式稳定存在,约为63kD的融合蛋白,为抗体的制作准备了条件。35S启动下过表达OsC2HC-1::GFP基因拟南芥萌发后期抗性分析实验表明,在125mmol/LNaCl,1mmol/LNaHCO3,3mmol/LNaHCO3胁迫下,过表达OsC2HC-1::GFP的拟南芥比野生型优势生长,表现出较强的盐碱抗性和抗氧化性,说明OsC2HC-1基因与抗盐碱性及抗氧化性有关。

条锈菌诱导的小麦C3HC4型锌指蛋白基因的克隆及其特征分析

应用电子克隆和RT-PCR方法,从小麦叶片中首次分离出1个条锈菌诱导的编码C3HC4型锌指蛋白基因的cDNA序列,暂被命名为TaZFP1。TaZFP1包含一个完整的849 bp的开放阅读框,编码282个氨基酸,具有C3HC4保守结构域;小麦TaZFP1氨基酸序列与水稻OsZFP1相似性达89%,与玉米ZmZFP1相似性达81%。TaZFP1在小麦根、茎、叶组织中表达量基本一致。在小麦与条锈菌的亲和、非亲和互作中,TaZFP1基因均受条锈菌诱导高水平表达,且非亲和组合表达量高于亲和组合,表明TaZFP1可能参与小麦对条锈菌的防御反应。

B型肉毒毒素重链C端基因的表达与保护作用的初步研究

肉毒毒素是肉毒梭状杆菌产生的外毒素,有7种血清型(A～G),是目前已知的毒性最强的细菌蛋白质。人类肉毒中毒主要是由A、B和E型引起。本研究克隆了B型肉毒毒素重链C端片段(Hc),在大肠杆菌中进行了诱导表达,并用Ni离子亲和柱进行了纯化。Hc蛋白免疫后的BALB/c小鼠可以抵抗6×103LD50B型肉毒毒素攻击。

重组金属硫蛋白HcMT的原核表达及其与金属离子竞争反应

[目的]在不同p H范围内和不同时间下检测重组Hc MT结合的锌、铜离子的含量,对金属离子竞争结合金属硫蛋白的特征进行分析。[方法]构建重组表达载体,将重组质粒p ET-32a-Hc MT进行原核表达,诱导时加入Zn2+,获得菌体后超声破碎,上清中添加Cu2+,分离纯化融合蛋白Trx A-Hc MT,检测金属硫蛋白溶液紫外吸收情况。样品硝化后用ICP-OES检测金属硫蛋白结合的金属离子含量。[结果]在p H 3~9的范围内,重组Hc MT上结合的Zn2+含量随着p H值升高而升高。加入Cu2+后,重组Hc MT上结合的Cu2+浓度上升,Zn2+浓度下降。在p H 3时,重组Hc MT结合金属离子的比值Cu2+/Zn2+为最小值0.68,在p H 8时Cu2+/Zn2+为最大值1.48,有利于Cu2+竞争。当p H 8时,不同时间下Zn-Hc MT与Cu2+的竞争结果表明1 h时锌铜有竞争高峰。[结论]证明了铜离子可以取代结合在重组HcMT上的锌离子,在p H 7~9范围中结合1 h竞争效率最高,该研究为重组Hc MT在重金属解毒方面的应用奠定基础。

蒲公英根提取物通过下调Nanos1表达抑制三阴性乳腺癌细胞恶性表型的研究

目的:探究蒲公英根提取物对三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer, TNBC)细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响及其作用机制。方法:采用CCK-8法检测蒲公英根提取物对MDA-MB-231人乳腺癌细胞及4T1小鼠乳腺癌细胞增殖的抑制作用。通过划痕实验与Transwell侵袭实验检测蒲公英根提取物对两种细胞系迁移及侵袭能力的影响。利用RNA-seq测序分析蒲公英提取物对TNBC转录组的影响,并对Nanos C2HC型锌指蛋白1(Nanos C2HC-type zinc finger 1,Nanos1)的表达及患者预后进行分析。结果:与空白对照组相比,蒲公英根提取物组细胞增殖能力降低,迁移距离降低,侵袭数量下降(P<0.01);蒲公英根提取物组细胞Nanos1表达下调(P<0.01),且Nanos1的低表达与乳腺癌患者生存时间呈正相关(P<0.01)。结论:蒲公英根提取物通过下调Nanos1的表达抑制TNBC细胞增殖、迁移及侵袭能力。