L-选择蛋白在小鼠肝癌细胞高低转移株HCa-F、HCa-P的表达及与肿瘤转移潜能的相关性

目的 探讨经淋巴道转移的小鼠肝癌细胞高低转移株HCa F、HCa P淋巴道转移能力及与淋巴细胞归巢受体L 选择蛋白的相关性。方法 应用免疫印迹分析、RT PCR及流式细胞术检测小鼠肝癌HCa F、HCa P细胞表面L 选择蛋白的表达情况 ,再通过E 、P 、L 选择蛋白的抗体对细胞粘附实验的影响检测HCa F、HCa P细胞淋巴道转移潜能与L 选择蛋白的相关性。结果 L 选择蛋白在HCa F、HCa P细胞表面均有表达 ,且HCa F细胞的表达量明显高于HCa P细胞 (P <0 .0 1) ,HCa F细胞与淋巴结之间的粘附可被抗L 选择蛋白的抗体所阻断。结论 小鼠肝癌细胞高低转移株HCa F、HCa P细胞均表达L 选择蛋白 。

小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系HCa-P/L_6细胞模型的建立及其药物敏感性的评价

[目的]建立小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系HCa-P/L6细胞模型并应用姜黄素对该模型的药物敏感性进行评价。[方法]将小鼠腹水型肝癌淋巴道低转移细胞株（HCa-P）经615小鼠腹中线皮下接种的方法获得淋巴结转移瘤1代细胞HCa-P/L1,再经小鼠淋巴系统筛选5次,筛选高转移细胞系HCa-P/L6。用15～240μmol·L^-1姜黄素（Curcumin,Cur）分别处理人肝癌细胞系（SMC7721和HepG2）和小鼠腹水型肝癌细胞（HCa-P/L6和HCa-P）48h,以MTT法考察4种细胞的药物敏感性。以非细胞毒性最大剂量Cur作用于HCa-P/L6和HCa-P,以生长曲线和群体倍增时间评估药物对细胞生长的影响,以流式细胞仪检 测药物对细胞周期分布的影响,考察两株小鼠腹水型肝癌细胞与姜黄素作用敏感性的差异。[结果]从HCa-P中筛选出具有多部位转移特性的淋巴道高转移细胞系HCa-P/L6,转移率为100%。Cur明显抑制小鼠腹水型肝癌和人肝癌细胞的增殖,并呈 剂量依赖性（方差分析P〈0.05）。在30～120μmol·L^-1,Cur对小鼠肝癌的抑制作用强于对人肝癌的抑制作用;在60～240μmol·L^-1范围内,Cur对HCa-P/L6的抑制作用强于对HCa-P。在非细胞毒性最大剂量15μmol·L^-1 Cur作用下,HCa-P/L6和HCa-P的生长受到抑制（t检验P〈0.05）,并且呈时间依赖性（方差分析P〈0.01）,HCa-P/L6和HCa-P的群体倍增时间延长（卡方检验P〈0.01）,Cur对HCa-P/L6的抑制作用大于对HCa-P;细胞周期被重新分布,HCa-P/L6被阻滞在S期,HCa-P被阻滞于S期和G2/M期。[结论]从HCa-P中筛选出了淋巴道高转移细胞系HCa-P/L6。小鼠腹水型肝癌比人肝癌对姜黄素作用敏感,而且高转移细胞株系HCa-P/L6较低转移细胞株HCa-P对Cur更为敏感。HCa-P/L6为肿瘤淋巴道转移机制和中药活性成分筛选的研究提供了一个新的敏感模型。

应用表达芯片筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关基因

目的采用表达芯片比较高、低淋巴道转移力小鼠肝癌腹水型细胞株Hca-F和Hca-P的基因表达谱,以筛选出与肿瘤淋巴道转移相关的基因。方法分别提取Hca-F和Hca-P细胞的总RNA,反转录合成生物素标记的cRNA探针,并与A ffy-m etrix GeneCh ip MOE430A(包括22 690个转录本,对应于约14 500个小鼠已知基因和4 371个EST)杂交,检测结果利用生物信息学进行分析。结果Hca-F和Hca-P相比,在14 500个已知基因中,有901个(6.2%)表达上调幅度≥2倍;在4 371个EST中,有129个(3%)上调幅度≥2倍。公布了差异表达≥8倍的37个基因并根据Gene Ontology(GO)分类和TreeV iew分析,按照其参与的生物学过程和具有的分子功能进行了功能分类。其中有19个基因参与了组织发生、细胞黏附、信号转导、细胞生长、分化及代谢等的生物学过程,29个基因分别具有转运、移动、蛋白激酶、蛋白结合及受体活性等分子功能,7个基因的生物学功能尚不清楚。结论表达芯片检测与肿瘤淋巴道转移模型相结合,为肿瘤转移研究提供新方法、新思路,一些过量表达的基因将为肿瘤转移机制的研究提供新线索。

小鼠腹水型肝癌高低转移细胞株DARS2蛋白表达的差异

[目的]研究具有高、低转移潜能的小鼠腹水型肝癌细胞株Hca-F与Hca-P中线粒体的天门冬氨酰转移核糖核酸合成酶(DARS2)蛋白表达的差异。[方法]将Hca-F细胞与Hca-P细胞分别接种于615小鼠腹腔,抽取腹水,培养后收集细胞;用免疫印迹分析及免疫细胞化学方法检测Hca-F与Hca-P细胞的DARS2蛋白表达。[结果]DARS2在高转移细胞株Hca-F与低转移细胞株Hca-P表达量分别为(0.219±0.016)与(0.473±0.043),二者比较差异有显著性意义(P=0.01)。[结论]DARS2蛋白表达降低可能与小鼠肝癌转移相关。

小鼠转移性肝癌细胞系基因组不稳定性的比较研究

目的 观察小鼠高、低转移性肝癌细胞系Hca／16A3-F(F)和Hca／A2-P(P)发生基因组不稳定性的情况,探讨它们与肝癌发生及转移之间的关系。方法 随机选择42个微卫星多态标记,采用聚合酶链式反应-简单重复序列多态性(SSLP)法对F和P细胞进行分析。结果 小鼠高、低转移性肝癌细胞系的微卫星基因座表型与近交系C3H小鼠等位基因相比,在P细胞有30个基因座与近交系C3H小鼠相同,8个基因座丢失等位基因,5个基因座出现额外条带,4个基因座发生带移位。F细胞有28个微卫星基因座与近交系C3H相同,12个基因座发生等位基因丢失,4个基因座出现额外条带,1个基因座发生带移位。P和F细胞的等位基因条带存在明显差异。结论 小鼠高、低转移性肝癌细胞系存在基因组不稳定性,并在小鼠肝癌的发生发展中起重要作用,源自纯合性小鼠的一个肿瘤的两个亚克隆细胞系存在不同的遗传学特征。

ANXA11表达稳定下调的肝癌Hca-P细胞株的建立

目的构建针对膜联蛋白A11(Annexin A11,ANXA11)的shRNA(small hairpin RNA),稳定转染小鼠低淋巴道转移力肝癌Hca-P细胞,筛选ANXA11稳定下调的单克隆细胞株,为后续研究奠定基础。方法合成2条ANXA11的shRNA序列(shRNA-1和-2),与真核表达载体pGPU6/GFP/Neo连接,构建pGPU6/GFP/Neo-shR-NA-ANXA11表达载体并转染Hca-P细胞,通过G418筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株,Western blot检测Hca-P细胞ANXA11蛋白表达,并与空载体转染及对照组比较。结果成功构建了pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11重组表达质粒,并获得pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11-Hca-P单克隆细胞株;shRNA-1重组质粒的抑制效果在mRNA和蛋白水平对ANXA11抑制率分别为80.2%和77.7%,P<0.01。结论通过RNA干扰和基因转染技术成功建立了ANXA11表达稳定下调的Hca-P细胞株,得到了其单克隆细胞株,为进一步研究ANXA11在恶性肿瘤淋巴道转移中的作用及机制打下了基础。