类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统的Hcp1蛋白转位介导多核巨细胞形成

目的探讨类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统溶血素共调节蛋白1(hemolysin coregulatory protein 1,Hcp1)在感染宿主细胞引起多核巨细胞(multinucleated giant cells,MNGC)形成的作用及机制。方法分别采用同源重组和质粒回补技术构建类鼻疽菌hcp1基因缺失株(BPC006Δhcp1)和缺失回补株(BPC006Δhcp1::hcp1);分别用类鼻疽菌BPC006野生株、BPC006Δhcp1和BPC006Δhcp1::hcp1感染RAW264.7细胞,通过激光共聚焦分析Hcp1蛋白的定位情况;在293T细胞中转染Hcp1真核表达载体后进行细胞质膜分离进一步验证定位情况;在细胞感染模型上,通过吉姆萨染色检测抗Hcp1多克隆抗体封闭对MNGC形成的影响,探究Hcp1在类鼻疽菌感染导致的MNGC形成中的作用和生物学意义。结果Western blot检测结果显示BPC006Δhcp1不表达Hcp1蛋白,而BPC006Δhcp1::hcp1能恢复Hcp1蛋白的表达,成功构建类鼻疽菌BPC006Δhcp1和BPC006Δhcp1::hcp1。细胞免疫荧光共定位实验和质膜分离实验都表明Hcp1可以定位在宿主细胞膜上,且相较于对照组抗Hcp1多克隆抗体能抑制类鼻疽菌感染所诱导的MNGC形成(P<0.01)。结论类鼻疽菌感染RAW264.7细胞时Hcp1可转位至细胞膜,并在MNGC形成中发挥重要作用。

农杆菌介导瞬时沉默小麦HCP1的研究

【目的】建立农杆菌介导的瞬时沉默小麦HCP1的方法,为简便、快速、高效地研究小麦基因功能提供一种可靠的技术支持。研究HCP1在叶锈菌侵染过程中对H2O2的清除作用,为阐明小麦抗叶锈菌侵染中信号转导机制奠定理论基础。【方法】采用农杆菌注射法,将携带有pe GFP载体的农杆菌注射到小麦叶片中,观察叶片中荧光强度及分布,分析外源质粒在小麦叶片中的表达情况。通过注射EHA105、LBA4404和C58C1 3种不同的农杆菌菌株,将HCP1的RNAi载体导入小麦叶片细胞中,利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测HCP1瞬时沉默效率,并结合Rohringer染色分析,明确不同农杆菌对寄主叶片侵染能力的强弱,从而筛选出最适的试验菌株。在瞬时沉默的小麦叶片上,接种不亲和叶锈菌小种260,利用DAB染色,观察接种叶锈菌后叶片中H2O2的变化,分析HCP1在小麦与叶锈菌互作过程中的功能。【结果】叶片GFP荧光观察结果说明,在注射农杆菌48 h后GFP开始出现较高表达。RT-PCR和q RT-PCR结果表明,注射C58C1菌株的叶片12 h后,HCP1的表达量开始降低,并持续保持较低的表达量。注射EHA105菌株的叶片,在注射后72—96 h,HCP1的表达量迅速降低。而注射LBA4404菌株的叶片中HCP1的表达量基本没有变化。所以在3种不同农杆菌菌株介导的HCP1 RNAi转化中,沉默效率依次为:C58C1≥EHA105>LBA4404。注射不同农杆菌菌株叶片的Rohringer染色结果发现,EHA105侵染后引起的HR反应较其他两种菌株明显,说明EHA105对小麦叶片具有较高毒性,会引起叶片产生防卫反应,C58C1菌株在具有较高的沉默效率同时,对叶片的毒性较小,因此选取C58C1作为最适的试验菌株;沉默HCP1的小麦叶片接种叶锈菌小种260后,通过DAB染色发现,接种24 h和48 h后叶锈菌侵染诱发的小麦叶片H2O2的分布及积累量均多于对照组。【结论】建立了农杆菌介导的瞬时基因沉默体系,选用C58C1农杆菌菌株作为试验菌株,在处理后72 h可达到沉默目的基因的效果。确定HCP1参与了小麦与叶锈菌互作过程中H2O2的清除途径。

禽致病性大肠杆菌CE129 Ⅵ型分泌系统主要亚单位基因hcp1、hcp2缺失株的构建与验证

为获得禽致病性大肠杆菌(APEC)CE129 Ⅵ型的hcp1、hcp2基因缺失株,本研究利用Red同源重组系统对APEC野生株CE129的Ⅵ型分泌系统(T6SS)hcp1和hcp2基因进行敲除,获得hcp1、hcp2基因单缺失株CE129△hcp1、CE129△hcp2和双缺失株CE129△hcp1△hcp2。将hcp1、hcp2基因分别克隆到表达载体pBR322和pACYC184中,构建相应的基因回补株CE129△hcp1/phcp1、CE129△hcp2/phcp2和CE129△hcp1△hcp22/phcp1phcp2。通过PCR特异性检测和基因测序显示,上述突变株与回补株均成功构建,且均能够稳定遗传。上述基因缺失株和回补株的成功构建,有助于深入了解APEC CE129菌株T6SS的作用机制,为进一步研究APEC的致病机理及其防控奠定了基础。

运动性低血色素形成中大鼠十二指肠铁吸收蛋白HCP1、DMT1及FPN1表达的动态变化

目的:研究运动性低血色素形成中大鼠十二指肠铁转运蛋白血红素转运蛋白1(heme carrier protein 1,HCP1)、二价金属离子转运体1(divalent metal transporter1,DMT1)及膜铁转运蛋白1(ferroportin1,FPN1)表达的动态变化,探讨运动性低血色素的发生机制。方法:36只雄性Wistar大鼠随机分为对照组和运动组。运动组大鼠进行为期5周、6 d/周、坡度为0、速度30 m/min的递增负荷跑台训练。前2周每天训练1次,时间从1 min开始,每次递增2 min。从第3周开始,每天训练2次。分别于运动第3、4、5周末取材,采用血细胞自动分析仪测定血红蛋白(Hb)含量;Western Blot检测十二指肠上皮细胞HCP1、DMT1及FPN1表达。结果:(1)长时间大强度运动后大鼠Hb含量逐渐降低。运动组3周末Hb与其对照组相比有下降趋势,4周和5周末显著低于其对照组(P<0.05,P<0.01)。(2)运动组大鼠3周末小肠上皮细胞HCP1、DMT1及FPN1表达均显著高于其对照组(P<0.01),4周末与其对照组相比均无显著差异(P>0.05),5周末均显著低于对照组(P<0.01)。结论:大强度运动开始阶段,机体通过增加肠铁吸收维持运动机体对铁的需求,随运动时间延长,机体肠铁吸收能力降低,这是引发运动性低血色素的重要原因之一。

H-NS蛋白对副溶血弧菌hcp1的转录调控

【目的】研究调控子H-NS对副溶血弧菌T6SS1结构蛋白基因hcp1的转录调控机制。【方法】利用Western blot检测Hcp1蛋白在野生株(WT)和hns基因敲除株(Δhns)中表达水平的差异。提取WT和Δhns的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法验证H-NS对hcp1的转录调控关系。进而采用引物延伸实验研究hcp1的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对hcp1的调控关系。PCR扩增hcp1的整个启动子区DNA序列,并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证His-H-NS对hcp1启动子区是否具有直接的结合作用。【结果】Western blot和实时定量RT-PCR结果显示H-NS能抑制hcp1的表达;引物延伸结果显示hcp1只有一个转录起始位点T(–62)(翻译起始位点为+1),且其转录活性是H-NS和σ54依赖性的;EMSA实验表明H-NS对hcp1的启动子区具有直接的结合作用。【结论】H-NS能直接结合到hcp1启动子区而抑制其转录表达。