香港海鸥菌HdeA蛋白的原核表达及活性研究

目的表达香港海鸥菌(Laribacter hongkongensis)分子伴侣蛋白HdeA并鉴定其保护功能,为解析其抗酸机制奠定基础。方法通过与相关蛋白进行同源性比较,在香港海鸥菌中找出编码HdeA的基因。以HdeA基因序列为基础,设计特异性引物,PCR扩增HdeA基因,并将其连接到表达载体pET28a,构建的重组质粒pET28a-HdeA转化大肠埃希菌BL21(DE3),得到重组菌BL/pET28a-HdeA,用IPTG诱导表达目的蛋白并利用镍柱亲和层析纯化HdeA蛋白,采用光散射法分析HdeA蛋白的保护功能。结果通过Blast分析,从香港海鸥菌中找到编码HdeA的基因。以合成的特异性引物扩增出约315bp的HdeA片段,连接到原核表达载体pET28a后转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导成功表达出HdeA蛋白,其分子质量单位为14.1ku,与理论值相符合。经His-tag亲和层析纯化,获得纯度较高的重组HdeA蛋白。光散射法检测分析HdeA蛋白能够减轻酸性条件下ADH蛋白聚集。结论纯化的重组HdeA蛋白在体外具有抗酸功能,为研究香港海鸥菌的抗酸机制奠定了基础。

蛋白质之活细胞探究

人类对蛋白质的认识过程经历了200多年,但大部分研究都在活细胞体之外开展.随着认识生命之手段和方法的不断更新与改进,科学家更加关注生命体内发生的事件.因此,从体外到体内,从定性到定量将成为蛋白质研究领域的新趋势.本文简要总结了活细胞内蛋白质研究的现状以及我们实验室的部分代表性研究成果.首先介绍已经建立的主要方法体系,包括绿色荧光蛋白标记法、活细胞核磁共振波谱法、非天然氨基酸标记法等.之后,重点介绍非天然氨基酸标记方法体系,以及我们实验室对这一技术体系进行的改进,包括:创建用于在目标蛋白质中引入非天然氨基酸Bpa的LY928大肠杆菌菌株;建立将非天然氨基酸随机引入目标蛋白质的任何氨基酸残基位点的方法体系;建立直接在大肠杆菌基因组中对目标蛋白质编码基因进行碱基点突变的方法体系;开发单块胶可分析384种蛋白质样品的高通量聚丙烯酰胺凝胶电泳技术.为说明这种通过非天然氨基酸引入而开展活细胞内蛋白质研究体系的有效性,列举了我们实验室所获得的部分代表性成果:在研究细菌分裂关键蛋白质FtsZ动态组装机制时意外发现的、存在于停止分裂细胞中的、可逆亚细胞结构——复苏延迟体(regrowth delay body);揭示细菌ATP合酶复合体在细胞处于不同条件下实施独特的"换挡"活性调节机制;揭示一种参与细菌外膜蛋白新生肽链转运的超级蛋白质复合体的存在;揭示抗酸分子伴侣蛋白HdeA在极端酸性细胞条件下通过丧失其三维空间结构而保护包括中性分子伴侣蛋白在内的底物蛋白质的独特机制;揭示一直被认为具有双功能的DegP蛋白主要发挥蛋白质水解酶功能,不具明显的分子伴侣功能;揭示活细胞中小分子热休克蛋白响应温度变化而发生层级性结构和活性变化.最后,作者通过提出一系列有待回答的科学问题对在活细胞中探究蛋白质的前景进行了展望.