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产气荚膜梭菌β-毒素基因的克隆及CPB-ST融合基因的构建 被引量:2
1
作者 王玉炯 许崇波 +2 位作者 冯书章 朱平 殷震 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第4期372-378,共7页
用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,从B型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了 930bp的 β -毒素基因。用限制性核酸内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对PCR产物进行双酶切处理 ,然后 ,通过T4DNA连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的载体质粒 pET ... 用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,从B型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了 930bp的 β -毒素基因。用限制性核酸内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对PCR产物进行双酶切处理 ,然后 ,通过T4DNA连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的载体质粒 pET - 2 8C(+)的多克隆位点 ,转化至受体菌BL2 1(DE3)中。经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切分析和PCR扩增检测。证明重组质粒 pECB2中含有产气荚膜梭菌的 β -毒素基因。经核苷酸序列分析 ,明确了克隆的 β -毒素基因在重组质粒中的连接向位和阅读框架是正确的。利用已构建的另一重组质粒pXST1(带有肠毒素性大肠杆菌的耐热性肠毒素ST基因 ) ,通过EcoRⅠ和SalⅠ双酶切处理 ,将切下的ST基因片段定向连接到 pECB2重组质粒中CPB基因的下游。经特定酶切分析鉴定 ,得到了理想重组子质粒pECB -ST1,CPB -ST融合基因在重组质粒 pECB 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 β-毒素基因 st基因 融合基因
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大肠杆菌肠毒素ST_1—LT_B融合基因的高效表达 被引量:1
2
作者 许崇波 卫广森 +4 位作者 王卓 冯书章 吴广谋 王文成 张万林 《卫生研究》 CAS CSCD 北大核心 1998年第S1期42-46,共5页
用限制性核酸内切酶EcoRI和HindⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的质粒pXSLT1,回收0.84kb的ST1—LTB融合基因,再将载体pET—28b(+)用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,然后将其与... 用限制性核酸内切酶EcoRI和HindⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的质粒pXSLT1,回收0.84kb的ST1—LTB融合基因,再将载体pET—28b(+)用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,然后将其与ST1—LTB融合基因连接,转化至受体菌BL21(DE3)中。经EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组质粒pXET-SLT1。重组菌株BL21(DE3)(pXETSLT1)经IPTG诱导后,其表达产物经SDS—PAGE和ELISA检测,结果表明重组菌株可以高效表达ST1—LTB融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的33.21%。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 β-毒素基因 st基因 融合基因
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人产肠毒素大肠杆菌ST、LT-B肠毒素基因融合的研究 被引量:3
3
作者 汪江 陈添弥 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1995年第2期173-178,共6页
将人产肠毒素大肠杆菌(ETEC),编码耐热肠毒素(ST)的基因片段与编码不耐热肠毒素B亚基(LT-B)的基因进行融合,并在此基础上进行不同数目ST基因的串联,ELISA检测融合基因表达蛋白产物观察到ST与LT-B之间存在着相互影响。ST的检测滴度随基... 将人产肠毒素大肠杆菌(ETEC),编码耐热肠毒素(ST)的基因片段与编码不耐热肠毒素B亚基(LT-B)的基因进行融合,并在此基础上进行不同数目ST基因的串联,ELISA检测融合基因表达蛋白产物观察到ST与LT-B之间存在着相互影响。ST的检测滴度随基因串联个数增加而逐渐升高,而LT的ELISA滴度则减弱。说明了ST可以通过基因串联提高表达产物抗原活性,这为产肠毒素大肠杆菌多价疫苗的研制提供了重要的研究基础。 展开更多
关键词 产肠毒素 大肠杆菌 st LT-B 基因融合 病原菌
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大肠杆菌耐热性肠毒素ST Ⅰ突变体与黏附素K99融合基因的构建及其表达
4
作者 李敏 郭乐 +2 位作者 王亮 王玉炯 赵辉 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第12期7-10,共4页
采用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌C83922质粒中扩增出耐热性肠毒素(STⅠ)和黏附素K99基因片段,进一步结合基因重组技术成功构建了含有融合基因ST Ⅰ-Linker-K99的重组质粒pMSLK;通过PCR和寡核苷酸定点突变技术将STⅠ毒素中心的6个Cys分别... 采用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌C83922质粒中扩增出耐热性肠毒素(STⅠ)和黏附素K99基因片段,进一步结合基因重组技术成功构建了含有融合基因ST Ⅰ-Linker-K99的重组质粒pMSLK;通过PCR和寡核苷酸定点突变技术将STⅠ毒素中心的6个Cys分别突变成Ser和Gly,经亚克隆后将含有突变位点的融合基因插入到pET-20b表达载体中,获得了重组质粒pES(S)LK和pES(G)LK;将以上2种质粒分别导入到BL21(DE3)菌株中,成功构建BL21(DE3)(pES(S)LK)和BL21(DE3)(pES(G)LK)2种重组菌株,对其表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。结果表明:这两种重组菌株都能高效表达ST Ⅰ突变体与K99的重组蛋白,而且表达的融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别。 展开更多
关键词 产肠毒素大肠杆菌 耐热性肠毒素 黏附素 融合基因
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人毒素原性大肠杆菌肠毒素ST、LT-B基因的融合
5
作者 汪江 陈添弥 《生物技术通讯》 CAS 1994年第1期8-12,共5页
将毒素原性大肠杆菌(ETEC)编码耐热肠毒素(ST)的基因片段与编码热敏肠毒素B亚基(LT—B)的基因进行融合,并在此基础上进行不同数目ST基因的串联。ELISA检测融合基因表达蛋白产物,观察到ST与LT-B之间存在着相互影响。ST的检测滴度随基因... 将毒素原性大肠杆菌(ETEC)编码耐热肠毒素(ST)的基因片段与编码热敏肠毒素B亚基(LT—B)的基因进行融合,并在此基础上进行不同数目ST基因的串联。ELISA检测融合基因表达蛋白产物,观察到ST与LT-B之间存在着相互影响。ST的检测滴度随基因串联个数增加而逐渐升高,而LT的ELISA滴度则减弱。本研究说明ST可以通过基因串联提高表达产物抗原活性。这为毒素原性大肠杆菌多价疫苗的研制提供了重要的研究基础。 展开更多
关键词 毒素原性大肠杆菌 st LT-B 基因融合 重组疫苗
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利用重组PCR技术构建大肠杆菌肠毒素LT_B0ST_I融合基因 被引量:1
6
作者 王莹 周智爱 +1 位作者 李震 曹祥荣 《上海农业学报》 CSCD 2001年第1期39-44,共6页
利用重组PCR技术将从原始菌种中扩增得到的LTB、STI 基因片段连接起来 ,构建了LTB STI 融合基因。并将其克隆到 pUCm T载体上 ,转化到大肠杆菌DH5α中 ,得到克隆T LS ,序列分析表明该克隆具有正确的基因序列和阅读框 ,具有起始密码子AT... 利用重组PCR技术将从原始菌种中扩增得到的LTB、STI 基因片段连接起来 ,构建了LTB STI 融合基因。并将其克隆到 pUCm T载体上 ,转化到大肠杆菌DH5α中 ,得到克隆T LS ,序列分析表明该克隆具有正确的基因序列和阅读框 ,具有起始密码子ATG和终止密码子TAA 。 展开更多
关键词 产肠毒素性大肠杆菌 耐热性肠毒素 重组PCR LTB-stI融合基因
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抗STa多克隆抗体的制备、鉴定和纯化 被引量:2
7
作者 胡文丽 匡雪 +3 位作者 简宗辉 王皓然 段锐锐 陈培富 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第5期1082-1087,共6页
产肠毒素大肠杆菌(ETEC)可引起人及动物急性腹泻,其关键毒力因子为耐热肠毒素(ST)。由于ST是一种具有强烈毒性但缺乏免疫原性的小分子肽,如何在保持其免疫原性的同时减弱其毒性已成为制备ST类毒素疫苗的研究热点。本试验以利凡诺法提纯... 产肠毒素大肠杆菌(ETEC)可引起人及动物急性腹泻,其关键毒力因子为耐热肠毒素(ST)。由于ST是一种具有强烈毒性但缺乏免疫原性的小分子肽,如何在保持其免疫原性的同时减弱其毒性已成为制备ST类毒素疫苗的研究热点。本试验以利凡诺法提纯兔血清白蛋白(RSA),经0.2%戊二醛活化,再与人工合成的甲醇可溶性STa偶联,十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示获得分子质量约108.5ku的完全抗原。用该偶联物免疫新西兰白兔4次,采集抗血清并用Protein A/G琼脂糖小珠进行纯化,斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA)和免疫印迹(Western blotting)结果显示抗血清效价均为1∶400。试验结果表明抗STa多克隆抗体成功制备,这为筛选ST结构类似物做有益的铺垫。 展开更多
关键词 耐热肠毒素(st) 偶联物 多克隆抗体
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产肠毒素性大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)提纯方法研究
8
作者 黄晓哲 谢梅雯 +2 位作者 沈健民 虞丽琴 司马蕙兰 《中国公共卫生学报》 1990年第5期310-312,共3页
本文运用硫酸铵沉淀、羟基磷灰右处理、酒精抽提、Sp-sephadex C-25阳离子交换凝胶柱及DEAE-Sephadex A-25阴离子交换凝胶柱交换洗脱以及高压液相色谱法进行产肠毒素大肠杆菌(ETEC)耐热性肠毒素(ST)的纯化,从10000ml细菌培养液中获得纯... 本文运用硫酸铵沉淀、羟基磷灰右处理、酒精抽提、Sp-sephadex C-25阳离子交换凝胶柱及DEAE-Sephadex A-25阴离子交换凝胶柱交换洗脱以及高压液相色谱法进行产肠毒素大肠杆菌(ETEC)耐热性肠毒素(ST)的纯化,从10000ml细菌培养液中获得纯化ST1.05mg。 展开更多
关键词 ETEC 耐热性肠毒素 提纯
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大肠杆菌热稳定肠毒素与霍乱毒素B亚单位融合蛋白免疫原性的评价 被引量:1
9
作者 任立成 赵志虎 +2 位作者 刘传暄 赵之伟 马清钧 《生物技术通讯》 CAS 2003年第5期369-371,共3页
构建了霍乱毒素B亚单位CTB和大肠杆菌热稳定肠毒素ST的重组表达载体pMCST1、pMCST2。二者的不同是,前者为单拷贝ST,后者为双拷贝ST。在大肠杆菌DH5α中融合蛋白高效表达。用这两种重组蛋白分别免疫小鼠,都诱导产生了高滴度的抗CTB和抗S... 构建了霍乱毒素B亚单位CTB和大肠杆菌热稳定肠毒素ST的重组表达载体pMCST1、pMCST2。二者的不同是,前者为单拷贝ST,后者为双拷贝ST。在大肠杆菌DH5α中融合蛋白高效表达。用这两种重组蛋白分别免疫小鼠,都诱导产生了高滴度的抗CTB和抗ST的血清。表明这两组融合蛋白具有良好的CTB和ST的免疫原性,为进一步构建抗CTB和抗ST的产毒性细菌腹泻疫苗打下了基础。 展开更多
关键词 霍乱毒素B亚单位 大肠杆菌热稳定肠毒素 疫苗 重组表达载体
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大肠杆菌肠毒素二价苗构建的研究进展(综述) 被引量:1
10
作者 王莹 李震 +1 位作者 周智爱 曹祥荣 《上海农业学报》 CSCD 2000年第3期29-31,共3页
产肠毒素性大肠杆菌 (ETEC)是引起幼畜、婴幼儿及旅游者腹泻的重要病原菌之一。肠毒素是其主要的毒力因子 ,包括耐热性肠毒素 (ST)和热敏感肠毒素 (L T)。STI基因和 L TB基因融合后产生的融合蛋白不仅增强了 STI 的免疫原性 ,而且降低了... 产肠毒素性大肠杆菌 (ETEC)是引起幼畜、婴幼儿及旅游者腹泻的重要病原菌之一。肠毒素是其主要的毒力因子 ,包括耐热性肠毒素 (ST)和热敏感肠毒素 (L T)。STI基因和 L TB基因融合后产生的融合蛋白不仅增强了 STI 的免疫原性 ,而且降低了 STI 的生物毒性 ,这就给抗幼畜腹泻的基因工程亚单位苗开发带来了新的希望。 展开更多
关键词 耐热性肠毒素 热敏感肠毒素 基因工程亚单位二价苗 幼畜腹泻 大肠杆菌毒素
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大肠杆菌热稳定肠毒素表位与霍乱毒素B亚单位的重组与表达 被引量:1
11
作者 任立成 胥全彬 +3 位作者 张助 赵志虎 刘传暄 马清钧 《生物技术通讯》 CAS 2003年第2期101-104,共4页
霍乱毒素B亚单位(CTB)是半抗原的良好载体,选择CTB基因的翻译调控元件,实现了串联重复的突变型大肠杆菌热稳定肠毒素(ST)表位与CTB的重组,在大肠杆菌中高效分泌表达,经过亲和层析获得了高纯度的重组蛋白,ELISA表明重组蛋白仍保留与神经... 霍乱毒素B亚单位(CTB)是半抗原的良好载体,选择CTB基因的翻译调控元件,实现了串联重复的突变型大肠杆菌热稳定肠毒素(ST)表位与CTB的重组,在大肠杆菌中高效分泌表达,经过亲和层析获得了高纯度的重组蛋白,ELISA表明重组蛋白仍保留与神经节苷脂GM1的结合能力和CTB的免疫原性。 展开更多
关键词 大肠杆菌热稳定肠毒素 霍乱毒素B亚单位 细菌性腹泻 免疫原性 基因重组 基因表达
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Calcium-sensing receptor: A new target for therapy of diarrhea 被引量:2
12
作者 Sam Xianjun Cheng 《World Journal of Gastroenterology》 SCIE CAS 2016年第9期2711-2724,共14页
Management of acute diarrhea remains a global challenge, particularly in resource-limiting countries. Oral rehydration solution (ORS), a passive rehydrating therapy developed approximately 40 years ago, remains the ma... Management of acute diarrhea remains a global challenge, particularly in resource-limiting countries. Oral rehydration solution (ORS), a passive rehydrating therapy developed approximately 40 years ago, remains the mainstay treatment. Although ORS is effective for hydration, since it does not inhibit enterotoxin-mediated excessive secretion, reduced absorption and compromised barrier function - the primary mechanisms of diarrhea, ORS does not offer a rapid relief of diarrhea symptom. There are a few alternative therapies available, yet the use of these drugs is limited by their expense, lack of availability and/or safety concerns. Novel anti-diarrheal therapeutic approaches, particularly those simple affordable therapies, are needed. This article explores intestinal calcium-sensing receptor (CaSR), a newly uncovered target for therapy of diarrhea. Unlike others, targeting this host antidiarrheal receptor system appears &#x0201c;all-inclusive&#x0201d;: it is anti-secretory, pro-absorptive, anti-motility, and anti-inflammatory. Thus, activating CaSR reverses changes of both secretory and inflammatory diarrheas. Considering its unique property of using simple nutrients such as calcium, polyamines, and certain amino acids/oligopeptides as activators, it is possible that through targeting of CaSR with a combination of specific nutrients, novel oral rehydrating solutions that are inexpensive and practical to use in all countries may be developed. 展开更多
关键词 Secretory diarrhea Inflammatory diarrhea Oral rehydration solution Anti-secretory Pro-absorptive Intestinal permeability Intestinal barrier function Enteric nervous system Cholera toxin Escherichia coli heat stable toxin
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CTB-mST2融合蛋白在大肠杆菌表达及其生物活性鉴定
13
作者 赵聪 张艳红 +1 位作者 张部昌 马清钧 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2007年第3期208-212,共5页
目的:表达霍乱毒素B亚单位(CTB)和大肠杆菌突变的热稳定肠毒素(mST)的融合蛋白,并进行抗原性和免疫原性的分析。方法:通过连接肽(linker)将CTB基因和串连的mST连接,然后插入表达载体pET-22b(+),获得克隆,经IPTG诱导获得CTB-mST2融合蛋... 目的:表达霍乱毒素B亚单位(CTB)和大肠杆菌突变的热稳定肠毒素(mST)的融合蛋白,并进行抗原性和免疫原性的分析。方法:通过连接肽(linker)将CTB基因和串连的mST连接,然后插入表达载体pET-22b(+),获得克隆,经IPTG诱导获得CTB-mST2融合蛋白。采用多因素正交优选法优化了培养基及培养条件,对表达产物进行包涵体复性后,经过亲合层析纯化得到融合蛋白,并对该融合蛋白抗原性和免疫原性进行了分析。结果与结论:构建了高效表达工程菌,经摇瓶培养,在优化培养基及培养条件下融合蛋白表达量可达320 mg/L,占总蛋白40%。融合蛋白免疫小鼠,可获得高滴度抗CTB和ST血清;将融合蛋白与灭活的O157∶H7菌体组合免疫小鼠,可产生对O157∶H7毒株攻击的保护力。本研究可为构建抗ETEC和EHEC复合疫苗提供依据。 展开更多
关键词 霍乱毒素B亚单位 大肠杆菌热稳定肠毒素 大肠杆菌O157:H7 疫苗
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LTB-2xSTN12S融合蛋白联合cGAMP和dmLT双佐剂对小鼠的免疫保护效果 被引量:1
14
作者 陈敬 张燕斌 +4 位作者 刘钰 王雪薇 钟佑秀 王平 刘梅影 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2020年第12期1345-1351,共7页
目的在原核系统中表达肠产毒性大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)不耐热肠毒素B亚基(heat labile enterotoxin B subunit,LTB)和耐热肠毒素(heat stable enterotoxin)突变体(STN12S)的融合蛋白,联合环鸟-腺二核苷酸(cy... 目的在原核系统中表达肠产毒性大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)不耐热肠毒素B亚基(heat labile enterotoxin B subunit,LTB)和耐热肠毒素(heat stable enterotoxin)突变体(STN12S)的融合蛋白,联合环鸟-腺二核苷酸(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate,cGAMP)和dmLT(double mutant heat-labile enterotoxin)佐剂初步评价其保护效果并进行免疫反应分析。方法构建表达质粒pET28α-LTB-2xSTN12S,转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,镍柱纯化,将纯化的重组LTB-2xSTN12S蛋白联合dmLT和cGAMP佐剂(为抗原+dmLT+cGAMP组;同时设空白对照组、感染对照组、抗原组),均经皮下途径免疫BALB/c小鼠,免疫2针,间隔2周,末次免疫2周后滴鼻攻击ETEC-HN临床分离株(LT+/ST+),2周后称重,取眼眶静脉血及脾淋巴细胞进行体液和细胞免疫分析。结果重组质粒pET28-LTB-2xSTN12S基因测序正确,纯化的重组LTB-2xSTN12S蛋白相对分子质量约20000,纯度为93%,与霍乱毒素(cholera toxin,CT)和ST多抗均能发生特异反应。抗原+dmLT+cGAMP组小鼠诱导的免疫保护均高于感染对照组和抗原组(P均<0.05),诱导的针对LTB-2xSTN12S血清IgG抗体水平及针对LTB和ST抗原特异性IgG抗体水平均高于其他组(P均<0.05);脾淋巴细胞培养上清中抗LTB-2xSTN12SIgG抗体水平及针对LTB-2xSTN12SLTB抗原特异性IgG抗体水平均显著高于其他组(P均<0.01),诱导的脾淋巴细胞抗原特异性IL-4、IL-6、IL-17和IFNγ细胞因子分泌细胞数量均高于其他组(P均<0.05)。结论经原核表达系统成功表达并纯化了LTB-2xSTN12S融合蛋白,LTB和ST抗原性良好,联合cGAMP和dmLT佐剂对同时表达LT和ST临床分离株的攻击具有保护效果,并检测到显著的特异性体液和细胞免疫反应。 展开更多
关键词 LTB-2xstN12S融合蛋白 cGAMP dmLT 双佐剂 肠产毒性大肠埃希菌 不耐热肠毒素 耐热肠毒素 免疫保护效果
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小分子蛋白酶抑制剂及多肽毒素的研究回顾 被引量:3
15
作者 戚正武 《科学通报》 EI CAS CSCD 北大核心 2009年第18期2734-2745,共12页
对以往小分子蛋白酶抑制剂及多肽毒素的研究成果作一历史性回顾,重点介绍了Bowman-Birk家族的绿豆胰蛋白酶抑制剂,对此抑制剂的Lys活性功能区作了解析.它是双头抑制剂,有两个功能区,用蛋白与基因测序、基因表达、突变、肽段合成等手段证... 对以往小分子蛋白酶抑制剂及多肽毒素的研究成果作一历史性回顾,重点介绍了Bowman-Birk家族的绿豆胰蛋白酶抑制剂,对此抑制剂的Lys活性功能区作了解析.它是双头抑制剂,有两个功能区,用蛋白与基因测序、基因表达、突变、肽段合成等手段证实,其核心结构是一个由两个相连九元环组成的16肽,与天然14环肽的向日葵抑制剂极类似.另一深入研究的抑制剂是27肽的天花粉胰蛋白酶抑制剂,属于南瓜族,介绍了该家族的基因序列.多肽毒素的研究包括蝎毒毒素及芋螺毒素.本文介绍了多种东亚马氏钳蝎新的钾通道毒素,有的是钙离子依赖的BK或SK钾通道毒素,有的是电压门控毒素,有的具有两个不同的功能区,阐明了它们的构效关系.表达的重组蝎氯毒素有望用于恶性胶质瘤的治疗.芋螺毒素分子量小、序列多变、功能广泛,有更好的应用前景.从中国南海16种芋螺中纯化了50个结构新的芋螺毒素,克隆了134个新基因;确定了3个新超家族,命名为V,Y,K超家族;研究发现,在某些芋螺毒素一级结构中有新的二硫键骨架和二硫键配对、独特的模板(motif)、氨基酸的D型化等;分析了A超家族的基因组结构,在内含子的3′端有一非常保守的序列,可用作引物克隆更多新的芋螺毒素基因;阐明了个别芋螺毒素的生理功能. 展开更多
关键词 活性多肽 舒缓激肽增强肽 南瓜族蛋白酶抑制剂 Bowman-Birk家族 蛋白酶抑制剂 大肠杆菌耐热肠毒素 东亚马氏钳蝎毒素 中国南海芋螺毒素
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