大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１ＬＴＢ融合蛋白的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗１５ＭＬＤ的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ，ＳＴ＋，ＬＴ＋）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ＳＴ１的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。

幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB融合蛋白的表达及生物活性研究

目的 通过基因工程方法构建并表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)以基因形式的融合蛋白,并对其生物活性进行初步研究,为幽门螺杆菌疫苗的研究奠定基础。方法 用PCR方法从本室构建的融合基因克隆载体扩增出融合基因2 040bp的片段,将融合基因插入原核表达载体pET-11-c中。结果 经全自动测序仪测序,SDS-PAGE和免疫印迹以及N端氨基酸测序分析,证实融合蛋白已在BL21中表达,初步纯化后通过动物实验和酶联免疫吸附试验证实其相应的免疫原性和免疫反应性,以及其中LTB成分和GM1结合的特性。结论 融合蛋白表达方式为幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗的研究奠定了基础。

大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63毒性检测及佐剂效果研究

目的对已构建的大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63进行表达、纯化、毒性检测,并对其佐剂活性进行研究。方法采用已知的最佳诱导表达条件进行诱导表达,诱导表达产物经亲和层析、纯化浓缩后,进行毒性检测。将纯化后的mLT63联合幽门螺旋杆菌(Hp)亚单位疫苗UreB、Omp11经口途径免疫BALB/c小鼠,免疫后取血清、胃组织提取液、粪便提取液进行ELISA试验,检测其中的特异性抗体水平,将结果进行统计分析。结果经家兔回肠袢毒性试验验证本室构建大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63没有毒性,mLT63联合Hp亚单位疫苗UreB、Omp11免疫小鼠实验证实mLT63具有佐剂活性。结论本室构建、表达的大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63无毒,并具有免疫佐剂的活性。

表达大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合蛋白基因工程菌株的构建

利用PCR技术 ,从大肠杆菌C8390 2质粒中扩增出K88ac基因、ST1 突变基因和LTB 基因 ,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化 ,构建了含K88ac ST1 LTB 融合基因表达载体的重组菌株BL2 1(DE3) (pXKST3LT5 )。经酶切鉴定和DNA序列分析证实 ,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac ST1 LTB 融合基因 ,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够被ST1 单抗、LTB 和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实 ,表达的融合蛋白已丧失天然ST1 肠毒素的活性。免疫实验结果表明 ,K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体 ,该抗体具有中和天然ST1 肠毒素的毒性作用 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄。

表达大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌K88ac_ST1_LTB 融合蛋白的工程菌株BL2 1 (DE3 ) (pXKST3LT5 )及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原 ,免疫小鼠 ,结果免疫小鼠至少能抵抗 2MLD的大肠杆菌强毒株C83 90 2 (K88ac,ST+ ,LT+ )的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后 ,采集的血清能够中和天然ST1的毒性。这表明构建的工程菌株BL2 1 (DE3 ) (pXKST3LT5 )可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。

LT-B转基因烟草植株的建立

目的 构建大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位 (LT B)基因的植物表达载体 ,并建立LT B转基因烟草植株。方法 用PCR从pMMB6 8扩增LT B编码基因 ,将其克隆于 pUCmT和 pBI12 1载体 ,进而构建植物表达双元载体pBI LTB ,LT B基因由CaMV 35S启动子控制表达 ;将pBI LTB用电穿孔法导入根瘤农杆菌LBA4 4 0 4 ;采用叶盘共培育法经根瘤农杆菌介导转化烟草 ,获得转基因烟草植株 ;用PCR、Southern、Westernblot和ELISA检测转基因植株。结果 经PCR及Southern杂交分析 ,共发现 12株烟草的基因组中有LT B基因整合 ;Westernblot和ELISA分析表明有 9株转基因烟草能有效表达LT B蛋白 ,其表达量为烟草叶片总可溶蛋白的 3.36～ 10 .5 6 μg·g-1TSP。结论 建立的LT B转基因烟草植株可成功表达LT B ,并具有五聚体结构 ,为进一步生产预防婴幼儿大肠杆菌腹泻可食用疫苗及黏膜免疫佐剂奠定了基础。

大肠杆菌肠毒素ST_1、LT_B基因融合及其免疫原性研究

目的:构建大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因,并研究其表达产物的免疫原性。方法:采用PCR和基因突变技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增ST1突变基因和LTB基因,通过基因分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建含ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株,并用酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒,同时用ST1-LTB融合蛋白粗提物免疫小鼠,观察免疫攻毒保护效果。结果:构建了含ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXSL1),ST1-LTB融合基因的序列和阅读框架均正确,其表达的ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗和LTB抗体识别,且该融合蛋白已丧失天然ST1肠毒素的活性。ST1-LTB融合蛋白能够诱发小鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素的毒性作用。结论:构建的重组菌株BL21(DE3)(pXSL1)可以高效表达ST1-LTB融合蛋白,其表达产物ST1-LTB融合蛋白具有良好的免疫原性,为更有效地预防仔猪黄痢提供了一种新型基因工程菌苗候选菌株。

人产肠毒素大肠杆菌ST、LT-B肠毒素基因融合的研究

将人产肠毒素大肠杆菌(ETEC),编码耐热肠毒素(ST)的基因片段与编码不耐热肠毒素B亚基(LT-B)的基因进行融合,并在此基础上进行不同数目ST基因的串联,ELISA检测融合基因表达蛋白产物观察到ST与LT-B之间存在着相互影响。ST的检测滴度随基因串联个数增加而逐渐升高,而LT的ELISA滴度则减弱。说明了ST可以通过基因串联提高表达产物抗原活性,这为产肠毒素大肠杆菌多价疫苗的研制提供了重要的研究基础。

K88ac^(+)产肠毒素大肠杆菌eltAB基因缺失对其生物学特性影响的研究

为研究热敏肠毒素(LT)对K88ac+产肠毒素大肠杆菌(K88ac^(+)ETEC)致病能力的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了eltAB基因缺失株C83902ΔeltAB,同时将重组质粒pBR322-eltAB电转化至C83902ΔeltAB菌株中获得回补株C83902ΔeltAB/pLT。比较3株菌的生长特性,结果显示相同的条件下,野生株、缺失株和回补株的生长速度无差异;采用ELISA方法检测3株菌感染仔猪肠道上皮细胞IPEC-J2后细胞内的环磷酸腺苷(cAMP)浓度,结果显示与缺失株相比,野生株和回补株感染后细胞内的cAMP浓度均极显著上升(P<0.01)。体外对IPECJ2细胞的黏附试验结果显示,缺失株的黏附能力较野生株极显著下降(P<0.01);而回补株的黏附能力得到恢复。采用RT-qPCR检测3种菌株感染IPEC-J2后炎性因子和紧密连接蛋白基因的转录水平,结果显示缺失株感染IPEC-J2细胞后,炎性因子TNF-α和IL-8的mRNA转录水平均极显著下降(P<0.01),而3株菌感染的细胞中紧密连接蛋白编码基因Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA转录水平均无变化。以上结果表明,LT毒素能够促进K88acETEC菌株对IPEC-J2细胞的黏附和诱导其炎性细胞因子的分泌,但并不能破坏肠道细胞屏障的完整性。本研究为进一步阐明K88acETEC的致病机制提供了重要的参考依据,同时为防治K88acETEC的感染提供了新的策略。

大肠杆菌K88ac,ST_1,LT_B基因融合

利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因,再从含ST1-LTB融合基因的重组质粒pXSLT1中扩增出ST1-LTB融合基因,构建了含K88ac-ST1-LTB融合基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(pET-28KSL).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pET-28KSL含有K88ac-ST1-LTB融合基因,且基因序列和阅读框架正确.经ELISA检测,重组菌株表达的K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够被ST1,LTB单抗和K88ac抗体识别,表明已成功构建了K88ac-ST-LT融合基因,并实现了在重组大肠杆菌中的表达.

大肠杆菌不耐热肠毒素基因克隆和无毒突变体mLT63的构建及序列分析

目的:大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)是很强的免疫原,也具有很强的粘膜免疫佐剂作用,但LT的毒性限制了它在人类疫苗中使用。本研究希望通过定点诱变构建无毒或减毒并保持LT免疫学特性的突变体。方法:以人源肠毒素大肠杆菌(ETEC)菌株E.coli44815为研究对象,应用本研究室改进的SDS裂解法小量制备含LT基因的野生大质粒,PCR扩增LT基因,构建重组质粒pNEB193_elt;采用重叠延伸法PCR对LT第63位氨基酸进行体外定点诱变,构建LT突变基因的重组克隆载体,测序并进行序列分析鉴定。结果:采用本研究室改进的SDS裂解法,可成功地小量提取满足扩增模板要求的大质粒;所克隆的LT基因与GenBank公布的一致;定点诱变正确,无非特异性突变。结论:克隆的LT野生基因和定点诱变基因可用于构建重组表达载体,表达重组蛋白,对其粘膜免疫佐剂性或其他相关特性进一步研究。

表达大肠杆菌肠毒素ST_1—LT_B融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴ－ＳＬＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＬＤ１００的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ，ＳＴ＋，ＬＴ＋）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ＳＴ１的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。

表达大肠杆菌LT-B/ST融合抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

编码LT-B/ST融合抗原的基因插入pYA248载体中,构建了重组质粒pXZL66。该重组质粒转入无毒鼠伤寒沙门氏菌SR-11,ΔCya,Δcrp,Δasd菌株X4072。此无抗药性的杂合菌株X4072(pXZL66)表达的LT-B/ST融合抗原具有LT和ST抗原性而没有生物毒性,可望成为预防ETEC腹泻和相应的沙门氏菌病双价口服活疫苗候选株。

表达大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合蛋白双价基因工程菌株的构建

重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以高效表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ 融合蛋白，该融合蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％ ，而且已失去天然ＳＴ１肠毒素生物毒性。用从ＩＰＴＧ 诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＭＬＤ 的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ，ＳＴ＋ ，ＬＴ＋ ）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性。

大肠杆菌LTB与幽门螺杆菌HSPA融合表达载体的构建与表达

目的 构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的包涵体形式融合表达载体。方法 PCR扩增LtB基因 ,并在其 5’端去掉信号肽 ,3’端去掉终止子 ,引入编码YPQD接头 ,通过PstI +BamHI酶切位点重组于PinPointTM Xa Ⅲ载体上 ,转化E .coliJM1 0 9,SDS PAGE及Western blot分析其表达。结果 成功构建了LTB融合表达质粒 ,并将幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与之融合获得了表达。结论 LTB融合表达载体的成功构建为研究分子内粘膜佐剂特性奠定了基础。

表达大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴ－ＳＬＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＬＤ１００的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ，ＳＴ＋，ＬＴ＋）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ＳＴ１的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。

应用Hoefer GE200 Gel Eluter纯化重组的LTB

目的 纯化基因重组表达的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)。方法 采用HoeferGE 2 0 0GelEluter从聚丙烯酰胺凝胶中回收LTB蛋白 ,SDS PAGE ,HPLC分析其纯度 ,western blot分析其免疫学性质。结果 电洗脱 1次可获得 30 0 μg重组蛋白 ,纯化蛋白经Tricine SDS PAGE电泳表现为单一蛋白质带 ,HPLC检测纯度为 99.4 6 % ,免疫印迹证实其保持有免疫学活性。结论 该系统纯化LTB蛋白操作方便、快捷 ,所得蛋白纯度好。

大肠杆菌热不稳定肠毒素无毒突变体LTR72基因重组质粒的构建

用PCR方法扩增大肠杆菌LT基因 ,将LT基因重组入pET32a质粒载体 ,对构建的重组质粒pET LT进行酶切、核苷酸序列分析 ,结果表明 ,插入片段LT的核苷酸序列与预期一致 ,且阅读框正确。并在影响LT毒性的关键氨基酸位点 ,用PCR方法引入点突变 (丙氨酸→精氨酸 ) ,成功构建了含有LTR72突变体基因的重组质粒pET LTR72。

实时荧光定量PCR检测感染小鼠肠道内容物的LT肠毒素基因

构建LT-PMD19质粒标准品,进行SYBR Green荧光定量PCR检测产肠毒素大肠杆菌(ETEC)LT基因,以确定该方法的特异性和灵敏度,绘制标准曲线;通过腹腔注射0.2mL ETEC菌液建立小鼠腹泻模型,分别于感染后4h、15h、2d、7d和14d各处死2只,通过建立的荧光定量PCR方法对小肠液中的ETEC的LT基因进行定量检测。研究结果显示,用建立的荧光定量PCR检测LT基因无非特异性扩增,标准曲线呈良好的线性关系(R2=0.999),标准品的熔解曲线均呈单峰,灵敏度为8.18×103拷贝数/μL;小鼠感染4h后LT毒素含量最高,剖检可见小肠肿大,充满黄绿色的内容物,感染后7d、14d均未检测出LT毒素,肠道未见明显病变,表明LT肠毒素在肠道内的生成规律与肠道病变损伤呈正相关。

重组LTB-UreB融合基因工程菌发酵工艺研究

目的 研究大肠杆菌表达重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB UreB)融合基因工程菌BL2 1的发酵工艺。方法 采用德国B Brau公司C 10型 15L发酵罐发酵 ,对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行了优化。结果 在优化的条件下 ,15L发酵罐发酵工程菌 ,菌体收获量可达 5 2 2g L ,目的蛋白表达量约占总蛋白的 2 7%。结论 此发酵工艺可以提高工程菌收获和目的蛋白的表达。