Sonic Hedgehog信号通路分子Shh和Smo在肝细胞肝癌中表达与意义

目的:探讨Sonic Hedgehog(SHH)信号通路分子Shh和Smo在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及其意义。方法:用RT-PCR方法检测10例HCC组织及相应癌旁组织和肝癌细胞系HepG2、Huh7中Shh、Smo mRNA的表达。采用免疫组化方法检测30例肝癌组织及10例正常肝组织中Shh、Smo蛋白的表达。结果:RT-PCR结果显示HCC组织中Shh、Smo mRNA的表达率显著高于癌旁组织(P<0.05);Shh、Smo mRNA在Huh7中的表达强度高于HepG2,但两者间无显著性差异(P>0.05)。免疫组化结果显示Shh、Smo蛋白在HCC组织中阳性率分别为63.3%(19/30)、76.7%(23/30);Smo蛋白的表达与肿瘤大小相关(P<0.05)。Shh、Smo蛋白在正常肝组织中均无表达。结论:Shh和Smo在肝癌中高表达,表明SHH信号通路可能参与肝癌的发生,为肝癌防治提供新的依据。

食管鳞状细胞癌成纤维细胞hedgehog通路对SHH蛋白的应答

目的探讨食管鳞状细胞癌成纤维细胞hedgehog通路是否应答SHH蛋白。方法分离、原代培养食管鳞状细胞癌成纤维细胞,用Western blot方法检测培养的细胞是否为成纤维细胞,SHH蛋白与细胞孵育后提取细胞总RNA,荧光定量PCR方法检测细胞中hedgehog通路是否应答。结果 Western blot结果显示培养细胞表达间质细胞标记Vimentin和Fibronectin,不表达上皮细胞标记E-cadherin。三株细胞中有两株应答SHH蛋白,一株不应答。结论食管鳞状细胞癌中,成纤维细胞对SHH配体是否应答存在着不同的情况,因此,检测间质中Hh通路的活性可为临床上选择对Hh抑制剂应答的肿瘤提供重要的生物标记。

ICR鼠皮肤Sonic Hedgehog(Shh)基因的克隆及表达

目的:检测ICR胎鼠皮肤组织克隆Sonic Hedgehog(Shh)基因在胎鼠皮肤的表达。方法:分离12.5～16.5 d胎龄的胎鼠背部皮肤,用Trizol-酚-氯仿抽提法提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增胎鼠皮肤Shh全部编码基因,重组于pMD19-T载体进行克隆测序分析。应用合成地高辛标记的反义Shh-mRNA探针,整体原位杂交技术检测Shh基因在ICR鼠皮肤上的表达。结果:从15.5 d胎鼠背部皮肤中成功扩增Shh基因,Blast分析与GeneBank公布的Shh基因编码区一致。同时15.5 d以后胎鼠背部皮肤检测到Shh基因的表达。结论:Shh基因可能参与了皮肤毛囊的形成。

Hedgehog信号通路分子Shh、Ptch和Smo在化学诱导小鼠肝癌模型过程中的动态表达

目的探讨C57BL/6J小鼠诱癌过程中Hedgehog信号通路成员Shh、Ptch和Smo在各阶段的动态表达。方法将95只正常C57BL/6J雄性小鼠随机分为诱癌组50只(化学诱癌处理)和对照组45只(正常喂养),定期获取小鼠肝组织标本行免疫组织化学法、实时荧光定量RT-PCR法和蛋白质印迹法检测。结果免疫组织化学提示,诱癌组Shh、Ptch和Smo蛋白分别在第6周、第8周和第10周出现弱阳性,均在第16周出现中度阳性,第20周出现强阳性表达,而正常对照组中未检测出三者的表达。RT-PCR法提示,诱癌组小鼠肝组织中Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA的表达量持续升高,第20周时三者的表达水平均达到最高(Shh mRNA 15.986±1.784,Ptch mRNA 11.272±0.295,Smo mRNA 10.185±0.716),明显高于同期正常对照组(P<0.05)。蛋白质印迹法提示,诱癌组Shh、Ptch和Smo蛋白分别从第6周、第8周和第10周起出现弱表达,到第20周时显著增强,而正常对照组中未检测出3种蛋白的表达。结论 Hedgehog信号通路分子Shh、Ptch和Smo伴随着小鼠诱发肝癌时间的延长其表达量逐步升高,认为Hedgehog信号通路与小鼠肝癌的发生、发展密切相关。

Gli2调控Hedgehog通路活化对Tca8113细胞增殖、转移和上皮间充质转化的影响

目的 本研究通过在细胞水平检测Gli2对口腔癌细胞Tca8113增殖、生长、迁移和侵袭的影响,明确Gli2调控口腔癌细胞迁移和侵袭的分子机制。方法 本研究利用siRNA抑制Tca8113细胞中Gli2的表达,通过CCK-8、平板克隆以及transwell小室实验分别检测Gli2对Tca8113细胞增殖、生长、迁移与侵袭的影响。进一步利用qRT-PCR与Western blot实验探究Gli2调控Tca8113细胞恶性增殖和转移机制。结果 口腔癌细胞Tca8113中Gli2的mRNA和蛋白表达升高。干扰Gli2表达可抑制Tca8113细胞增殖、生长、迁移及侵袭。进一步研究发现干扰Gli2表达可抑制Hedgehog(Hh)通路关键因子的mRNA与蛋白表达。此外,干扰Gli2表达可显著影响上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)通路关键因子的mRNA与蛋白表达。结论 口腔癌病变过程中Gli2被异常激活,干扰Gli2表达显著抑制口腔癌细胞的增殖、生长、迁移和侵袭。Gli2通过调控Hh通路与EMT通路,进而影响口腔癌细胞的迁移和侵袭。本研究为阐明口腔癌的发病机制提供新思路,并为口腔癌的临床治疗提供新视角。

小型猪乳磨牙胚SHH的时空表达

目的本研究通过探索SHH在小型猪第三乳磨牙胚的帽状期、钟状期和分泌期的时空表达情况,拟阐明SHH在牙齿发育调控中的作用。方法收集小型孕猪第三乳磨牙胚,通过原位杂交、免疫组化和实时聚合酶链反应检测SHH的m RNA和蛋白表达水平。结果原位杂交及免疫组化可见SHH在帽状期少量表达于成釉器,但在釉结部位表达较强。在钟状期,SHH在间充质中表达明显增强;在分泌期,SHH在间充质和成釉器中都有所表达,尤其在成牙本质细胞和内釉上皮细胞中表达增强。PCR结果显示,在钟状期,SHH在上皮中表达较多,而在帽状期和分泌期,SHH在上皮和间充质中的表达未见明显统计学差异。结论SHH可能在调节上皮形态发育方面具有重要功能,参与调节信号级联,介导上皮和间充质之间的相互作用,本研究进一步完善了小型猪牙齿发育的信号分子网络。

柚皮素激活SHH-GLI1信号通路对OGD/R诱导的神经元损伤的影响

目的探究柚皮素(NAR)对氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)诱导神经元损伤的改善作用及机制。方法将大鼠皮层神经元分为正常组、OGD/R组、NAR组和NAR+环巴胺组,给予相应处理。CCK-8法测定神经元活性;试剂盒测定神经元活性氧(ROS)、8-羟脱氧鸟苷(OHdG)、丙二醛(MDA)水平;TUNEL染色观察神经元凋亡;Western印迹检测声波刺猬(SHH)-胶质瘤相关癌基因同源物(GLI)1通路及脑源性神经营养因子(BDNF)、c-AMP反应元件结合蛋白(CREB)水平;免疫荧光染色观察GLI1的核移位。结果CCK-8法分析显示,40 mg/L NAR为最佳作用浓度。相较于正常组,OGD/R组神经元ROS相对荧光强度、8-OHdG、MDA水平、TUNEL+神经元数量、SHH、GLI1、Ptch1、BDNF、CREB蛋白及核/质GLI1水平明显增加(P<0.05);相较于OGD/R组,NAR组神经元ROS相对荧光强度、8-OHdG、MDA水平、TUNEL+神经元数量明显降低(P<0.05),SHH、GLI1、Ptch1、BDNF、CREB蛋白及核/质GLI1水平明显增加(P<0.05);相较于NAR组,NAR+环巴胺组神经元ROS相对荧光强度、8-OHdG、MDA水平、TUNEL+神经元数量明显增加(P<0.05),BDNF、CREB蛋白及核/质GLI1水平明显降低(P<0.05),SHH、GLI1、Ptch1蛋白无明显变化(P>0.05)。结论NAR可以减轻OGD/R诱导的神经元氧化损伤,其作用机制与激活SHH-GLI1通路有关。

基于Hedgehog通路探讨理肺消积丸对NSCLC A549细胞周期、增殖和迁移的影响

目的探讨理肺消积丸对A549细胞的影响作用及对Hedgehog通路的调控作用。方法采用MTT实验筛选理肺消积丸含药血清对A549细胞最佳干预浓度后,将细胞分为6组:对照组、理肺消积含药血清组、Hedgehog通路抑制剂组(Vismodegib组)、顺铂组、理肺消积含药血清+Vismodegib组、理肺消积含药血清+顺铂组。不同干预后,分别采用CCK-8实验检测细胞增殖能力,采用克隆形成实验观察细胞克隆形成能力,采用Transwell实验观察A549细胞迁移能力,采用流式细胞术观察细胞周期比例的变化,采用qRT-PCR和Western blot技术检测Hedgehog通路中Gli1、Ptch1、Smo和CyclinD1 mRNA和蛋白表达的变化。结果浓度为10%的理肺消积丸含药血清能显著抑制A549细胞增殖(P<0.05),降低细胞克隆形成和迁移能力(P<0.05),阻滞细胞周期从G1期到S期转变,同时抑制Gli1、Ptch1、Smo和CyclinD1 mRNA和蛋白表达(P<0.05),且与Vismodegib有良好的协同作用。结论理肺消积丸可显著抑制A549增殖和迁移能力,作用机制可能与其调控Hedgehog通路阻滞细胞周期有关。

Hedgehog信号通路在肝细胞癌中的作用及其与肿瘤微环境的关系

Hedgehog(Hh)信号通路在肝细胞癌的发生发展和肿瘤微环境中发挥重要作用。Hh信号异常激活可加速肿瘤的生长。Hh信号通路和肿瘤微环境之间的相互串扰与肿瘤的生长和抑制性肿瘤微环境的形成密切相关。有证据表明,抑制Hh信号在抑制肝细胞癌生长中发挥重要作用。本文就Hh信号异常激活在肝细胞癌和肝癌肿瘤微环境中作用及机制的研究现状与潜在的治疗意义作一综述,为肝癌的治疗提供新的思路。

Shh蛋白水平与肺腺癌临床特征及预后的关系

目的分析肺腺癌患者肺组织内音猬因子(Sonic Hedgehog,Shh)蛋白表达情况及其与患者临床特征和预后的关系。方法收集2010年3月至2015年9月期间于华中科技大学同济医学院附属同济医院行肺腺癌切除术的235例患者基本信息、切除的肺组织样本及肿瘤病理资料。采用组织芯片和免疫组织化学法测定Shh蛋白在肺癌及癌旁组织中的表达情况,运用Wilcoxon秩和检验分析Shh蛋白在肺癌组织及癌旁组织的表达差异,多元Logistic回归和Cox比例风险回归模型分析其与患者临床病理特征及预后的关联。结果肺腺癌组织中Shh蛋白表达水平明显高于癌旁组织(P<0.01)。肺腺癌与癌旁组织中Shh蛋白表达量的差值(癌/癌旁Shh蛋白表达量差值)和肿瘤大小显著负相关,癌/癌旁Shh蛋白IOD/Area差值、阳性细胞率差值及染色强度评分差值每增加1个单位,肿瘤发展为>7 cm的风险分别降低43%、4%和46%,其OR及95%CI分别为0.57(0.35,0.94)、0.96(0.94,0.99)和0.54(0.35,0.86);随着癌/癌旁Shh蛋白阳性细胞率差值的增加,肺腺癌患者肿瘤大小发展为>7 cm的风险逐渐降低(P趋势=0.011)。Cox比例风险回归模型显示,癌/癌旁Shh蛋白IOD/Area差值每增加1个单位,肺腺癌患者术后发生死亡的风险降低14%,其风险比(HR)为0.86,95%CI:(0.74,0.99);分层分析发现在中/高分化类型肿瘤和发生远处转移的患者中,癌/癌旁Shh蛋白IOD/Area差值每增加1个单位,患者发生死亡的风险可分别降低19%和38%,其HR(95%CI)分别为0.81(0.67,0.99)和0.62(0.41,0.94)。结论肺腺癌及癌旁组织内Shh蛋白表达量的差值与肺腺癌患者肿瘤大小及术后死亡风险显著负相关,提示其可能是肺腺癌患者术后生存的保护因素,为早期评估肺腺癌患者预后提供了新思路。

Hedgehog信号通路在骨折愈合中作用的研究

骨折在骨骼肌肉损伤中最为常见,其中一部分会发生骨折愈合延迟甚至骨不愈合,而针对这种情况的有效药物治疗手段还未发现。骨折愈合各个阶段均受到多种因素的影响,其中不同信号通路和相关细胞因子在愈合进程中发挥关键的作用。各项研究表明,Hedgehog信号通路可影响愈合过程中干细胞增殖分化、炎症反应、骨重建、神经再生、血管生成等多个方面,且可以受到各种激素作用和其他信号通路的共同调节,表明Hedgehog信号通路与骨折愈合密切相关。本文从上述多个角度出发分别进行综述,探究Hedgehog信号通路对愈合过程中不同环节的作用,希望为骨折愈合治疗提供新的靶点和治疗手段。

Sonic Hedgehog(Shh)蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义分析

目的研究Sonic Hedgehog(Shh)蛋白在胃癌及正常胃粘膜组织中的表达,探讨其表达与胃癌临床病理特点的关系。方法应用免疫组织化学方法检测Shh抗体在胃癌病理标本及正常胃粘膜组织标本中的表达情况。结果胃癌标本中Shh蛋白的表达阳性率为73.2%,正常胃粘膜表达阳性率为20%,P<0.05,差异具有统计学意义。结论 Shh蛋白的表达与胃癌恶性程度及TNM分期相关;参与了胃癌的发生进展。

基于Hedgehog信号通路的中医药干预慢性萎缩性胃炎的研究进展

慢性萎缩性胃炎是常见的胃癌前病变,不仅治疗过程漫长,治疗难度大,而且患者依从性欠佳。不仅会对患者的生理、心理健康和生活质量造成严重不良的影响,还会给患者家属造成负担,成为临床上不可忽视的难题。但是本病发病机制目前尚未完全明确,临床治疗还未达成共识。文章综述了近10年基于Hedgehog信号通路的中医药干预慢性萎缩性胃炎的研究概况。中医药调控Hedgehog信号通路辨证论治是治疗慢性萎缩性胃炎的一种独具特色的疗法,近年来有关基于Hedgehog信号通路的中医药干预治疗慢性萎缩性胃炎的报道越来越多。文章主要通过遵循疾病本虚标实的病性,以脾胃虚弱为本,瘀血、气滞、湿热、痰浊等为标,探讨选方治疗对慢性萎缩性胃炎的影响,认为中医药联合Hedgehog信号通路实行现代化发展能够有效干预治疗慢性萎缩性胃炎,以期为进一步临床研究与应用提供参考。

丹参酮Ⅱ_(A)通过调控Hedgehog/Gli1信号通路对乳腺癌 细胞迁移、侵袭的机制研究

目的探究丹参酮Ⅱ_(A)(TanⅡ_(A))对乳腺癌细胞迁移、侵袭的机制。方法使用不同浓度的TanⅡ_(A)对乳腺癌细胞系MCF-7进行治疗,MTT法检测细胞活力,流式细胞偶数检测细胞凋亡,Transwell法检测细胞迁移、侵袭能力。使用Hedgehog激活剂SAG激活Hedgehog/Gli1通路,使用qRT-PCR及免疫印迹检测SMO、Gli1 mRNA及蛋白表达水平。通过免疫印迹检测自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-1表达水平。结果50μmol·L^(-1) TanⅡ_(A)可以抑制MCF-7细胞活力,MDAMB-231细胞活力由(98.12±3.85)%下降至(69.32±3.68)%,MCF-7细胞活力由(99.32±3.65)%下降至(49.65±3.74)%。添加SAG后MCF-7细胞活力上升至(71.20±5.00)%(P<0.05)。SAG抑制MCF-7细胞凋亡,细胞凋亡率从(20.50±2.00)%下降至(12.00±1.00)%。SAG使得MCF-7细胞迁移数量从(52.00±5.00)上升至(76.00±5.00)(P<0.05),侵袭数量从(41.00±3.00)上升至(75.00±5.00)(P<0.05)。与Control组相比,TanⅡ_(A)组Beclin-1蛋白水平由(0.54±0.05)上升至(1.20±0.10),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平由(0.60±0.06)上升至(1.80±0.12)(P<0.05),而添加SAG后Beclin-1蛋白水平下降至(0.70±0.07)(P<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平下降至(0.75±0.04)(P<0.05)。结论TanⅡ_(A)降低乳腺癌细胞活力、迁移及侵袭能力,抑制Hedgehog/Gli1信号通路活性,且促进乳腺癌细胞自噬。

Sonic Hedgehog信号通路参与椎间盘退变的研究进展

随着社会老龄化的加剧,越来越多的患者受到腰背痛的困扰,给患者和社会带来负担。椎间盘退变(IVDD)是导致慢性腰背痛的主要原因,阐明IVDD的致病机制对解决当前所面临的健康问题具有重要意义。近年来,关于Sonic Hedgehog(Shh)通路在IVDD中的研究报道不断出现,Shh信号通路在椎间盘的形成和出生后维持中具有重要作用,并且该通路的表达变化伴随着椎间盘的年龄相关性退行性改变,靶向Shh信号通路可能在IVDD治疗中具有重要意义。本研究对Shh通路在IVDD中的研究进展进行总结,试图探索该信号通路与IVDD的各种已知病理之间的可能联系,并对未来的研究内容进行展望,以期为探究IVDD的有效治疗方式及预防手段提供参考。

从“湿热致瘀”角度探讨幽门螺旋杆菌感染对慢性萎缩性胃炎Hedgehog及NOX/NF-κB/STAT1信号通路的影响

目的比较幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染与非Hp感染的慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)患者胃黏膜病理状态与刺猬蛋白-细胞表面受体Ptch-G蛋白偶联受体样蛋白Smo-胶质瘤相关癌基因同源蛋白Gli(Hedgehog信号通路,Hh-Ptch-Smo-Gli)及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶/核因子κB/转录信号转导子和转录活化子1(NOX/NF-κB/STAT1)信号通路相关因子表达差异,探究Hp促进CAG“炎癌转化”的生物学机制。方法纳入符合标准的43名CAG患者,分为CAG伴Hp感染组(Hp+CAG组,n=21)、CAG不伴Hp感染组(Hp-CAG组,n=22),观察两组患者胃黏膜苏木精-伊红(HE)染色组织形态学改变,采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测胃黏膜NOX1、NOX2、NOX4、STAT1、P65、p-P65相对表达量;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测胃黏膜胶质瘤相关癌基因同源蛋白1 mRNA(Gli1 mRNA)、胶质瘤相关癌基因同源蛋白2 mRNA(Gli2 mRNA)、胶质瘤相关癌基因同源蛋白3 mRNA(Gli3 mRNA)、音猬因子mRNA(Shh mRNA)、G蛋白偶联受体样蛋白mRNA(Smo mRNA)、细胞表面受体Ptch mRNA(Ptch mRNA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1 mRNA(NOX1 mRNA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2 mRNA(NOX2 mRNA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4 mRNA(NOX4 mRNA)、核因子κB mRNA(NF-κB mRNA)水平。结果两组患者胃组织HE染色结果:Hp+CAG组患者胃黏膜上皮细胞部分坏死脱落,表面欠光整,腺体数量减少,排列紊乱,可见肠上皮化生,固有层内可见弥漫性淋巴细胞、中性粒细胞浸润;Hp-CAG组患者淋巴细胞和中性粒细胞浸润程度较Hp+CAG组轻。RT-qPCR检测结果:与Hp-CAG组相比,Hp+CAG组患者胃黏膜Gli1 mRNA、Shh mRNA、Smo mRNA、Ptch mRNA水平显著降低(P<0.01);Gli2 mRNA、Gli3 mRNA、NOX1 mRNA、NOX2 mRNA、NOX4 mRNA、NF-κB mRNA水平显著增高(P<0.01)。Western blot检测结果:与Hp-CAG组相比,Hp+CAG组患者胃黏膜NOX1/GAPDH(内参)、NOX2/GAPDH、NOX4/GAPDH、p-P65/GAPDH相对表达量明显增高(P<0.01),STAT1水平显著降低(P<0.01),两组P65/GAPDH相对表达量的差异没有统计学意义(P>0.05)。结论Hp感染后可能通过抑制Hh-Ptch-Smo-Gli信号通路,并使NOX/NF-κB/STAT1信号通路异常活化,导致胃黏膜长期炎症,促进萎缩及肠上皮化生,增加癌变风险。

续断壮骨方对胫骨干骨折大鼠Hedgehog信号通路的影响

目的旨在探讨续断壮骨方对胫骨干骨折大鼠Hedgehog信号通路的影响。方法将60只健康雄性3月龄无特定病原(Sprague dawley,SD)大鼠采用随机数字表法将其分为空白组、模型组、低剂量续断壮骨方组、高剂量续断壮骨方组,每组各15只,除空白组外其余各组均制备成胫骨干骨折模型,术后24 h,对照组及模型组灌服3 ml/d生理盐水;低剂量续断壮骨方组灌服40 mg/(kg·d),高剂量续断壮骨方组灌服80 mg/(kg·d),观察比较骨折术后各组第14、28、42天骨矿物质密度值(Bone mineral density,BMD)及骨痂体积,各组末次给药后观察各组大鼠生物力学性能、血管新生情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测各组大鼠胫骨切片Ihh mRNA、Smo mRNA、Ptch1 mRNA、GliL mRNA表达及Westem blot法检测各组骨痂组织Ihh、Smo、Ptch、GliL蛋白相对表达量。结果与空白组比较,模型组骨痂体积、BMD指数、胫骨最大载荷、新生血管面积、新生血管数量、Ihh mRNA、Smo mRNA、Ptch1 mRNA、GliL mRNA、Ihh、Smo、Ptch、GliL水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,低、高剂量续断壮骨方组骨痂体积、BMD指数、胫骨最大载荷、新生血管面积、新生血管数量、Ihh mRNA、Smo mRNA、Ptch1 mRNA、GliL mRNA、Ihh、Smo、Ptch、GliL水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与低剂量续断壮骨方组比较,高剂量续断壮骨方组骨痂体积、BMD指数、胫骨最大载荷、新生血管面积、新生血管数量、Ihh mRNA、Smo mRNA、Ptch1 mRNA、GliL mRNA、Ihh、Smo、Ptch、GliL水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论续断壮骨方能够通过上调胫骨干骨折大鼠Hedgehog信号通路发挥促进骨折愈合的作用。

Hedgehog通路异常激活对小鼠关节软骨稳态的影响

目的:探索Hedgehog通路在小鼠骨关节炎中的作用。方法:选取10周龄C57BL/6J雄性小鼠,在左侧后肢膝关节建立内侧半月板不稳定模型,右侧后肢膝关节为自身对照。术后8周处死建模组及对照组小鼠,收集其膝关节样本,体视镜观察膝关节破坏程度,显微CT(micro-CT)扫描分析半月板钙化程度,番红O-固绿软骨染色、甲苯胺蓝染色、苏木素-伊红染色和Ⅱ型胶原蛋白(Col2)免疫荧光染色观察软骨细胞外基质及软骨细胞变化,实时荧光定量PCR检测膝关节软骨Hedgehog信号通路重要分子平滑蛋白(Smo)、补缀同源物1(Ptch1)、神经胶质瘤相关癌基因同源物1(Gli1)基因表达水平及Col2、性别决定区Y框蛋白9(Sox9)、基质金属蛋白酶13(Mmp13)等软骨及其细胞外基质稳态相关分子表达变化。白细胞介素-1β(IL-1β)诱导ATDC5软骨细胞建立骨关节炎细胞模型,使用Smo抑制剂NVP-LDE225作用于细胞,实时荧光定量PCR检测Smo、Ptch1、Gli1、Col2、Sox9、Mmp13基因表达水平。结果:成功构建小鼠骨关节炎模型,建模组膝关节肿大,关节软骨表面出现损伤,钙化半月板体积高于对照组(P<0.01);膝关节软骨破坏,细胞外基质蛋白聚糖含量减少,软骨细胞排列紊乱;免疫荧光染色Col2阳性信号不连续;Col2、Sox9基因表达降低,Mmp13及Hedgehog通路相关分子Smo、Ptch1、Gli1基因表达高于对照组(P<0.05)。对软骨细胞使用Smo抑制剂NVP-LDE225可拮抗IL-1β诱导的Col2、Sox9基因表达降低及Mmp13、Smo、Ptch1、Gli1表达升高(P<0.05),挽救骨关节炎相关表型。结论:在骨关节炎状态下Hedgehog通路被异常激活,Hedgehog通路参与骨关节炎的发生发展。

乳酸通过胆固醇对非小细胞肺癌细胞中Hedgehog信号通路活性的影响

目的观测乳酸通过胆固醇对非小细胞肺癌细胞中Hedgehog(Hh)信号通路活性的影响。方法本研究用乳酸(0.0mM、7.5mM、15.0mM、20.0mM)和胆固醇(0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL)处理A549、NCI-H1703细胞6、24h,即刻检测Hh信号通路靶基因、胆固醇代谢合成酶相关基因或蛋白表达水平,并测定细胞内总胆固醇水平;为排除pH值对研究结果的影响,用相同浓度乳酸钠(7.5mM)处理A549、NCI-H1703细胞24h,用qPCR法检测胆固醇代谢合成酶相关基因表达水平;通过胆固醇合成酶抑制剂辛伐他汀(0.2uM)和乳酸(0.0mM、7.5mM、15.0mM、20.0mM)同时处理A549细胞24h,检测Hh信号通路靶基因表达水平;同时用RTCADPlus法检测增殖及迁移情况。结果经乳酸、胆固醇分别处理后的A549、NCI-H1703组细胞与对照组细胞比,前者GLII、PTCHImRNA水平上调(P<0.05);经乳酸处理后的A549细胞总胆固醇水平和HMGCR、FDFTI、SQLEmRNA水平均升高(P<0.001),同时HMCCR、FDFT1蛋白水平增高;经乳酸及乳酸钠分别处理后的A549、NCI-H1703细胞HMGCR、FDFTImRNA水平升高(P<0.01)。用0.2μM辛伐他汀下调胆固醇水平(P<0.05)后,GLI、PTCHImRNA水平下调(P<0.01);乳酸能够逆转辛伐他汀对GLII和PTCHImRNA水平的抑制作用,对A549细胞增殖(F=3.941,P=0.020)、迁移(F=5.851,P=0.003)能力的抑制作用。结论乳酸可能通过上调非小细胞肺癌细胞的胆固醇水平,促进Hh信号通路活性,并提高细胞增殖、迁移能力,提示抑制乳酸生成可能会改善辛伐他汀针对非小细胞肺癌的疗效。

左归丸含药血清对Hedgehog-GLi通路关键因子mRNA表达及骨吸收功能的影响

目的探讨左归丸含药血清对成骨-破骨细胞共培养体系中Hedgehog-GLi通路关键因子mRNA表达及骨吸收功能的影响。方法建立成骨细胞、破骨细胞、骨磨片共培养体系,实验分为7组:空白对照组、假手术组、OVX组、阳性对照组、左归丸组、激动剂组和激动剂+左归丸组。选用50只雌性SD大鼠,分别制备相对应组含药血清,实验各组分别加入相对应组大鼠血清。通过实时荧光定量PCR检测成骨细胞Ihh、Ptch、Smo、GLi1、OPG及RANKL的mRNA表达;并采用甲苯胺蓝染色方法检测破骨细胞骨吸收功能。结果与假手术组相比,OVX组Ihh、Ptch、Smo、GLi1mRNA表达显著上调,同时OPGmRNA表达水平显著降低,RANKL mRNA表达水平显著增加,RANKL/OPG比值明显增高。与OVX组相比,阳性对照组与左归丸组Ihh、Ptch、Smo、GLi1mRNA表达明显下调,同时OPG mRNA表达水平显著升高,RANKL mRNA表达水平显著降低,RANKL/OPG比值明显下降。OVX组加入激动剂Shh重组蛋白后,Hedgehog-GLi信号通路关键因子的mRNA表达较OVX组明显增加。与激动剂组比较,激动剂+左归丸组Ihh、Ptch、Smo、GLi1mRNA表达以及RANKL/OPG比值均明显下降。与假手术组相比,OVX组的骨吸收陷窝面积显著增加;与OVX组相比,阳性对照组和左归丸组的骨吸收陷窝面积显著下降。结论左归丸含药血清可一定程度上抑制Hedgehog-GLi通路关键因子Ihh、Ptch、Smo、GLi1的活性,进而抑制OVX所致的骨吸收增强。