从“肝肾同调”探析黑逍遥散干预AD免疫炎症的研究思路

阿尔茨海默病(AD)是一种年龄高度相关的神经系统疾病,是造成老年期痴呆的最主要原因,亦是导致老年人丧失日常生活能力的最常见疾病,将给患者、家庭及社会带来沉重的精神负担和经济压力。中医可将其归属于“痴呆”“呆门”“呆病”等疾患范畴,传统认为以肾虚为本,多从肾论治。课题组结合肝的生理病理特性,提出了“肝肾同调”是防治AD的重要思路。AD以β淀粉样蛋白(Aβ)沉积和神经原纤维缠结(NFT)为主要病理表现,其发病机制复杂。越来越多的研究表明,免疫炎症在AD的发病过程中起着重要作用,通过核转录因子-κB(NF-κB)/NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)/胱天蛋白酶-1(Caspase-1)/白细胞介素-1β(IL-1β)信号通路调控神经免疫炎症将是治疗AD的重要靶点。该文基于“肝肾同调”的重要思路,遴选其代表名方黑逍遥散,从调控NF-κB/NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路进而抑制神经免疫炎症角度探析防治AD的作用与机制,以期进一步推进黑逍遥散防治AD的深入研究,亦为中医药防治AD的思路策略抛砖引玉。

基于“三阴并调”探析黑逍遥散调控肠道菌群TMA/FMO3/TMAO代谢通路防治AD的思路与策略

阿尔兹海默病(AD)作为一种神经系统退行性疾病,随着老龄化进程的加快,罹患人数逐年增长,不仅威胁患者健康甚至生命,且给患者、家庭和社会造成沉重的经济负担和精神压力。中医学将其归属于"痴呆"等范畴,传统以补肾为其治要,而基于中医基本理论并结合AD的临床表现可见,AD与肝脾密切相关,因此,肝脾肾"三阴并调"将是防治AD的重要思路,黑逍遥散作为"三阴并调"的代表名方,具有防治AD的理论、实验及临床基础。现代研究表明,Tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结是其主要病理特征之一,氧化三甲胺(TMAO)与Tau蛋白过磷酸化关系密切,因此,调节TMAO代谢以抑制Tau蛋白过磷酸化是防治AD的新靶点。本文基于以上理论及研究基础,提出了"黑逍遥散通过‘三阴并调’调控肠道菌群三甲胺(TMA)/肝黄素单加氧酶3(FMO3)/TMAO代谢通路进而抑制大脑海马区Tau蛋白过磷酸化,从而达到保护神经细胞,改善学习记忆,防治AD"的研究假说,将从调控肠道菌群TMA/FMO3/TMAO代谢通路进而抑制Tau蛋白过磷酸化角度探析黑逍遥散防治AD的作用及其机制,为黑逍遥散防治AD的深入研究提出新的思路与策略。

黑逍遥散对AD模型小鼠海马区Aβ_(1-42),GSK-3β,NEP,IDE表达的影响

目的:研究黑逍遥散对阿尔茨海默症(Alzheimer disease,AD)小鼠海马区β淀粉样多肽1-42(β-amyloid 1-42peptide,Aβ1-42),糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β),脑啡肽酶(neprilysin,NEP),胰岛素抵抗酶(insulindegrading enzyme,IDE)表达的影响。方法:42只APP/PSI双转基因小鼠称体质量后,按随机原则分为4组,分别为模型组,阳性药组(盐酸多奈哌齐,3. 25 mg·kg-1),黑逍遥散高、低剂量组(6,3 g·kg-1)。10只同月龄、同种系的野生型C57BL/6J小鼠为正常组。连续灌胃12周后,Morris水迷宫予以行为学检测,苏木素-伊红(HE)染色观察海马神经元的形态改变,采用免疫组化技术分别检测小鼠海马区Aβ1-42,GSK-3β,NEP,IDE蛋白的表达。结果:治疗3个月后,与正常组比较,AD模型组小鼠,逃避潜伏期均延长,跨原平台次数减少(P <0. 01),小鼠海马区Aβ1-42,GSK-3β蛋白阳性表达显著增强,NEP与IDE蛋白阳性表达显著减弱(P <0. 01),HE染色显示AD模型小鼠海马神经细胞损伤严重;与模型组比较,用药各组小鼠的逃避潜伏期均显著缩短、跨原平台次数均显著增加(P <0. 05,P <0. 01),小鼠海马区Aβ1-42,GSK-3β蛋白阳性表达显著减弱,NEP与IDE蛋白阳性表达显著增强(P <0. 05,P <0. 01),HE染色显示各治疗组小鼠海马神经细胞损伤减轻。结论:黑逍遥散能够显著改善AD小鼠的学习记忆能力,可能与调节Aβ在海马区的异常沉积和降解作用等方面来减轻AD小鼠认知能力损伤有关。

黑逍遥散对AD模型小鼠海马区APP,PERK表达的影响

目的:研究黑逍遥散对阿尔茨海默症(AD)模型小鼠海马神经元内质网应激的影响,包括行为学、组织病理学及淀粉样前体蛋白(APP),类蛋白激酶内质网激酶(PERK)等因子的表达。方法:使用SPF级的4月龄双转基因(APP/PS1)雄性小鼠42只随机分为黑逍遥散高、低剂量组(6,3 g·kg-1),盐酸多奈哌齐组(3. 25 mg·kg-1)及模型组4组,同种系同月龄C57BL小鼠10只作为正常组。首先适应环境1周,经不同药物干预治疗2个月后,用Morris水迷宫行为学检测每组小鼠的学习和记忆能力;再治疗1个月后,通过光镜来观察每组小鼠海马区组织病理学改变;免疫组化、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测小鼠海马区细胞内质网组织中APP,PERK蛋白及mRNA的表达情况。结果:药物干预治疗后,与正常组比较,模型组小鼠的逃避潜伏期显著延长(P <0. 01);模型组小鼠海马区内神经元严重损伤;模型组APP,PERK的表达量显著升高(P <0. 01)。与模型组比较,各给药组小鼠逃逸潜伏期均明显缩短(P <0. 05,P <0. 01);海马区内神经元损伤程度均减轻;APP,PERK的表达均明显降低(P <0. 05)。结论:黑逍遥散能够显著改善AD小鼠的学习记忆能力,可能与减少内质网过度应激反应等方面来减轻AD小鼠认知能力损伤有关。

基于“肝肾相关”理论从Ca2+-CaM/CaMKⅡ-CREB信号转导途径探析黑逍遥散防治阿尔茨海默病的可行性

阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的增龄性神经退化性疾病,随着社会老龄化发展趋势而迅猛增加,严重威胁着人民群众健康,如果缺乏有效防治措施,将给社会经济和医疗保障体系造成巨大冲击。研究发现细胞信号转导异常是许多疾病发生的关键环节,细胞信号转导理论被广泛应用于阐明中医脏象实质和中医药作用机制的研究。"肝肾相关"是"五脏相关"理论的核心板块之一,适用于复杂疾病发病机制的阐释,解释多证候的相关性,及指导临证处方用药。黑逍遥散作为本研究组基于肝肾相关理论防治AD的首选复方,可通过疏肝养血、健脾益肾,通脑络利神窍而发挥防治AD作用。本文基于"肝肾相关"理论,从中医学角度阐述了AD的发病机制,通过查阅文献并结合前期研究,提出了从Ca2+-钙/钙调蛋白依赖性蛋白(CaM)/钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)-环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)细胞信号转导途径防治AD的方法与思路。

黑逍遥散对APP/PS1双转基因小鼠海马和脑皮层CaMKⅡα蛋白及其磷酸化表达的影响

目的:观察黑逍遥散对阿尔茨海默症(AD)小鼠海马和脑皮层钙调蛋白依赖性激酶2α(CaMKⅡα)及其磷酸化表达水平的干预效应。方法:30只APP/PS1双转基因雄性小鼠称体质量并按随机原则分为模型组、盐酸多奈哌齐组、黑逍遥散组,每组10只。同月龄、同种系的野生型C57BL/6雄性小鼠10只为空白组。盐酸多奈哌齐组(6 g·kg-1)、黑逍遥散组(3. 25 mg·kg-1)分别连续给药90 d后,Morris水迷宫检测行为学变化,免疫组化和蛋白免疫印迹法检测小鼠海马区和脑皮层CaMKⅡα蛋白及其磷酸化的表达。结果:干预90 d后,与空白组比较,AD模型组小鼠,逃避潜伏期显著延长,跨原平台和有效区域次数显著减少(P <0. 01),小鼠海马区及脑皮层Ca MKⅡα蛋白表达显著减弱或降低,而p-CaMKⅡα蛋白表达显著升高(P <0. 05,P <0. 01);与模型组比较,盐酸多奈哌齐和黑逍遥散组小鼠的逃避潜伏期均显著缩短、跨原平台次数均显著增加(P <0. 01),小鼠海马区及脑皮层Ca MKⅡα蛋白显著增强或升高,p-CaMKⅡα蛋白表达显著降低(P <0. 05,P <0. 01)。结论:黑逍遥散通过调节AD小鼠不同脑区参与细胞记忆形成机制的关键蛋白Ca MKⅡα及其磷酸化表达,进而发挥改善AD小鼠的学习记忆能力。

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨黑逍遥散对AD模型大鼠神经炎症的影响

目的:研究黑逍遥散是否可以通过调控激活Wntβ-连环蛋白(β-catenin)信号通路抑制阿尔茨海默病(AD)大鼠海马区炎症反应,改善AD大鼠认知和记忆功能障碍。方法:90只雄性Wistar大鼠先随机分别选择12只作为空白组和假手术组,剩余大鼠在左右两侧海马区注射β淀粉样蛋白42(Aβ42)制造AD模型大鼠,随机分为模型组、黑逍遥散低、中、高剂量组和多奈哌齐组,每组12只,并连续42 d给予相应剂量黑逍遥散和多奈哌齐灌胃。尼氏染色观察海马CA1区病理形态学变化;Morris水迷宫实验检测1~5 d大鼠逃避潜伏期的变化,第6天的空间探索能力。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠海马组织和血清中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测检测海马中海马区糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、β-catenin、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠GSK-3β、β-catenin、PPARγmRNA的水平。结果:与空白组比较,模型组大鼠海马CA1区神经元数量明显减少,排布不均,细胞体损坏比较明显,尼式小体不清;模型组大鼠第3~5天的逃避潜伏期均相比治疗组显著延长(P<0.01),跨台次数显著减少(P<0.01);模型组大鼠血清和海马组织中IL-10水平显著降低,IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.01);模型组GSK-3β蛋白和mRNA显著升高,β-catenin、PPARγ蛋白表达显著降低(P<0.01),差异较为明显;与模型组比较,黑逍遥散中、高剂量组和盐酸多奈哌齐组大鼠神经元细胞数量分布较多,排列整齐,结构完整,尼式小体清晰明确;黑逍遥散中、高剂量组和多奈哌齐组的第3~5天逃避潜伏期显著缩短(P<0.01),跨越平台次数显著增多(P<0.01);大鼠海马组织和血清中IL-10的表达水平明显升高,IL-6和TNF-α显著降低(P<0.01);大鼠海马中GSK-3β蛋白和GSK-3βmRNA表达明显降低,β-catenin、PPARγ蛋白和β-catenin、PPARγmRNA表达水平显著升高(P<0.01)。盐酸多奈哌齐组与黑逍遥散高剂量组之间各指标比较,差异无统计学意义。结论:黑逍遥散可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制AD大鼠海马区炎症反应,改善AD模型大鼠认知和记忆障碍。