不同氮磷钾配比对乌头生长及黑顺片品质的影响

附子是我国传统大宗药材之一。近年来,施用氮磷钾复合肥已成为提高种植附子产量的常规手段。但不同施肥模式下产出的附子及加工产品黑顺片的质量是否符合新版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)的规定尚不清楚,因此筛选科学的氮磷钾配施方案对附子产业的质量提升具有重要意义。笔者在陕西省城固县开展大田试验,通过对13种不同施肥处理下附子产量、加工产品黑顺片的主要有效成分的含量以及经济效益等进行综合分析,筛选科学的氮磷钾配施方案。结果表明,不同比例氮磷钾复合肥可以对附子产量及质量、黑顺片质量等影响不同,处理13(施用量N 450 kg/hm~2、P_(2)O_(5)84.375 kg/hm~2、K_(2)O 56.25 kg/hm~2)的附子双酯型生物碱和总生物碱含量较高,但是加工产品黑顺片的灰分、酸不溶性灰分及浸出物的含量均不符合新《中国药典》要求,处理5(施用量N 450 kg/hm~2、P_(2)O_(5)168.750 kg/hm~2、K_(2)O 112.50 kg/hm~2)的附子产量和生物碱含量有所增加,但是经济效益一般,相比之下,处理6(施用量为N 450 kg/hm~2、P_(2)O_(5)253.130 kg/hm~2、K_(2)O 112.50 kg/hm~2)的经济效益高,加工的黑顺片符合新《中国药典》要求,同时不危害当地生态环境,最值得推广,且根据主成分分析得出附子的产量、附子的生物碱和黑顺片灰分是决定附子综合品质的关键因素。

基于UHPLC-DAD技术测定附子生品及炮制品酯类生物碱含量及急性毒性评价

目的 利用UHPLC-DAD建立附子生品及炮制品中6种酯类生物碱成分定量的方法,并测定其在不同煎煮时间水提物中的含量,以便对中草药材附子的急性毒性进行监测和评估。方法 采用Waters ACQUITY BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7μm)来进行梯度洗脱,流动相A为5 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸水溶液,流动相B为乙腈:甲醇(v/v:1/3);流速为0.2 mL/min;检测波长235 nm;柱温35℃。结果 建立了附子生品及炮制品水提物在不同的煎煮时间内6种酯类生物碱成分含量同时测定的方法。6种酯类生物碱成分都表现出良好的线性(R2≥0.99),并且稳定性、精密度和重复性良好,RSD值均小于3.00%,回收率为94.8%~103.6%,并发现炮制后附子双酯型生物碱含量降低;之后采用急性毒性试验进行验证。对于KM小鼠,生附片水提物灌胃LD50为51.783 g生药/kg,蜜附片和黑顺片水提物MFD分别为80 g生药/kg和160 g生药/kg。结论 附子生品及各炮制品中6种成分含量均有所差异,对正常小鼠都具有一定的急性毒性,但炮制后毒性显著降低,其中用蜂蜜炮制能够降低附子的毒性,为附子临床用药及相关经典名方开发提供参考。

基于电子鼻技术的附子(黑顺片)等级及产地的区分研究

目的建立气味指纹图谱,探索区分黑顺片产地以及等级的有效方法。方法采用电子鼻技术对20批黑顺片进行检测,获得电子鼻在传感器的响应值,并利用主成分分析(PCA)、判别因子分析(DFA)对响应值进行数据处理。结果经PCA分析,20批黑顺片样品能明显区分开,DFA分析能区分黑顺片产地以及等级。结论采用电子鼻技术建立了黑顺片气味识别方法,该方法可以用于产地和等级的区分,为中药的快速鉴别及气味的客观化提供借鉴。

黑顺片总生物碱对番泻叶致小鼠腹泻及大鼠离体小肠平滑肌运动的影响

目的:考察黑顺片总生物碱对番泻叶致小鼠腹泻及大鼠离体小肠平滑肌运动的影响。方法:采用番泻叶致小鼠腹泻模型,以小肠推进率为考察指标,观察黑顺片总生物碱对小鼠腹泻的影响;采用大鼠离体小肠平滑肌实验,以小肠平滑肌收缩的振幅和张力为考察指标,观察黑顺片总生物碱对小肠平滑肌运动的影响及其作用机理;采用HPLC法,分析黑顺片总生物碱中的化学成分。结果:黑顺片总生物碱能显著减慢腹泻小鼠小肠推进运动(P<0.05),并能剂量依赖性降低正常大鼠离体小肠平滑肌收缩的振幅和张力,对氯化乙酰胆碱、甲硫酸新斯的明所兴奋的小肠平滑肌运动均具有一定的抑制作用,但对硫酸阿托品所抑制的小肠平滑肌运动无明显影响。经HPLC分析,苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱及苯甲酰次乌头碱均是黑顺片总生物碱的主要化学成分。结论:黑顺片总生物碱对腹泻小鼠具有一定的止泻作用,其作用机理可能与抑制M胆碱受体有关。

炮附片、黑顺片和白附片二维红外相关光谱的分析研究

采用红外光谱法(FTIR)并结合二维相关(Two-dimensional Correlation Spectroscopy)分析技术,对炮附片、黑顺片和白附片进行了无损快速鉴别研究。炮附片、黑顺片和白附片在一维谱图上差别不明显,而在二维谱图上凭借各官能团相互作用强度的不同而可以进行一一鉴别。在900～1500cm^(-1)波段内,炮附片在同步图上有一个较强的自动峰,在1220cm^(-1)附近。而黑顺片和白附片不仅在1220cm^(-1)有一个较强的自动峰,还在1200和1400cm^(-1)附近出现了自动峰,且白附片在1400cm^(-1)附近的自动峰比黑顺片的要更强一些;在交叉线的两侧,三者各官能团正的交叉峰白附片最多,黑顺片次之,炮附片最少。结果表明:凭借炮附片、黑顺片和白附片的二维红外相关谱可以作为药材不同炮制法的鉴别依据。该法快速、准确,为中药材的炮制鉴别提供了一种新的方法和手段。

超高效液相色谱-质谱法比较黑顺片单煎液及其复方煎煮液中次乌头碱在大鼠体内的吸收

为了研究有毒中药中主要成分的体内吸收,以黑顺片单煎液及其复方煎煮液"术附汤"和"甘草附子汤"灌胃大鼠血浆中的次乌头碱为检测指标,建立了血浆中次乌头碱的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF MS)检测方法,并采用内标法对其进行了含量测定,绘制了血药浓度-时间曲线,计算了药动学参数。方法学考察结果表明血中次乌头碱在0.02～10 ng/mL范围内呈现良好的线性关系;样品测定结果表明,"术附汤"中的某种或某些成分抑制了次乌头碱的体内吸收,而"甘草附子汤"中的某种或某些成分促进了次乌头碱的体内吸收,两复方功效差异可能来源于次乌头碱在体内吸收程度的不同。由3种煎煮液中次乌头碱的消除半衰期(T1/2)及血药浓度-时间曲线下面积(AUC)值推测次乌头碱在大鼠体内的转运过程为非线性动力学过程。

市售黑顺片口尝味道与生物碱及胆巴含量的关系探讨

目的:探讨黑顺片中生物碱含量及胆巴残留量与其味觉的关系,为黑顺片质量控制标准的完善提供参考。方法:高效液相色谱法(HPLC)检测黑顺片中6种生物碱成分的含量;Na 2EDTA络合滴定法检测胆巴残留量,结合人工口尝对黑顺片味道的测评,综合分析市售黑顺片样品间味道差异与两类成分的关系。结果:32批市售黑顺片中,单酯型生物碱总量均符合《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版规定;26批黑顺片的双酯型生物碱含量符合《中国药典》2015年版规定,有6批样品质量分数为0.021%~0.030%,合格率为81%,口尝麻舌感明显的黑顺片样品双酯型生物碱含量偏高;胆巴质量分数为1.85%~8.95%,咸味明显的黑顺片样品胆巴残留量偏高;收集的样品中黑顺片味道差异较大,符合《中国药典》2015年版“味淡”要求的约占16%。结论:收集的样品中黑顺片大多符合《中国药典》2015年版中生物碱的质控标准,但味道不合格的比较普遍,双酯型生物碱含量与黑顺片口尝麻舌感有关联性;胆巴含量与咸味有关联性,建议制定相应的胆巴残留量化标准。

黑顺片的二萜生物碱成分

常用中药川乌、附子为毛茛科乌头属植物乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)的母根和子根。从附子的加工炮制品黑顺片中分离鉴定了5种C19乌头碱型二萜生物碱和1个C20纳哌啉型二萜生物碱。通过MS、NMR、IR等波谱分析和已知化合物数据对照,分别鉴定为次乌头碱(1)、尼奥宁(2)、塔拉地萨敏(3)、多根乌头碱(4)、异塔拉萨定(5)和去氢松果灵(6)。

附子炮制品水煎液对比格犬心脏急性毒性研究

目的:比较附子不同炮制品(刨附片、炮天雄、黑顺片)对比格犬的心脏急性毒性的影响。方法:比格犬16只,随机分为空白对照组、刨附片组、炮天雄组、黑顺片组,按照4g生药/kg灌胃比格犬浓缩液,检测灌胃前和灌胃后1h,1d、3d、7d和14d后比格犬体重、体温变化和心电图心率变化,并测定血液中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的含量。结果:给药后1h内黑顺片组犬出现呕吐,其余组未观察到症状;给药后14d内比格犬体重、体温正常,给药组乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶含量,心电图心率与空白组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:刨附片,炮天雄,黑顺片水煎液按照4g生药/kg给犬灌胃,没有明显心脏毒性。

附子不同炮制品对麻黄细辛附子汤指纹图谱的影响研究

研究4种附子炮制品对麻黄细辛附子汤溶出度的影响,并建立指纹图谱,为麻黄附子细辛汤的临床使用提供根据。采用反相高效液相色谱,色谱柱选用美国安捷伦公司Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6×250mm,5μm),流动相使用甲醇及0.2%磷酸水溶液进行梯度洗脱,检测波长选取254nm,柱温30℃,记录60min内的指纹图谱。经方法学考察,该方法具有稳定性、可靠性、重复性,可用于检测附子不同炮制品的麻黄细辛附子汤指纹图谱。在麻黄细辛附子汤指纹图谱中共指定了7个共有指纹峰,并考察这7个共有峰在附子炮制方法不同时峰的保留时间与保留面积。附子炮制方法的不同较大的影响了麻黄细辛附子汤的指纹图谱,这进一步为关于麻黄细辛附子汤的化学成分及临床研究提供了依据。

炮附片HPLC特征图谱及炮制前后比较研究

目的建立炮附片HPLC特征图谱,分析炮附片炮制前后物质基础差异。方法AgilentExtend-C18(4.6 mm×250 mm,5μm);乙腈(A)-40 mM乙酸铵缓冲液(氨水调PH为10.5)(B),梯度洗脱,检测波长为240 nm,柱温为30℃,进样量为20μL。结果建立了炮附片HPLC特征图谱。生附子经炮制成为黑顺片后,11个峰的峰面积显著减小,3种单酯型生物碱含量降低,3种双酯型生物碱基本检测不到。黑顺片经砂炒制成炮附片后,3种单酯型生物碱含量进一步降低,且无新成分峰出现。结论生附子经炮制成为炮附片后,可使生附子的成分发生量变和质变。炮附片与黑顺片特征图谱基本一致,含量略有差别。

不同产地黑顺片醇提物对斑马鱼毒性和心率的影响

目的探讨不同产地黑顺片(四川江油、四川布拖、云南)对斑马鱼毒性和心率作用差异。方法将发育正常的胚胎期斑马鱼暴露在含有不同浓度的黑顺片提取物溶液中,分别在24、48、72、96 hpf阶段测定斑马鱼的心率、畸形率以及存活率等指标。结果不同产地黑顺片醇提物在一定浓度下,可使斑马鱼心率加快,出现畸形,存活率降低;其中以江油产黑顺片毒性最小,对心率的影响也较弱。结论生物学评价显示不同产地黑顺片醇提物对斑马鱼毒性和心率作用具有显著差异,其作用强弱与产地具有一定相关性,云南产地黑顺片毒性最大,江油产区最为温和,为黑顺片的临床应用提供一定的参考。

对《中国药典》黑顺片薄层色谱鉴别方法的商榷

目的探讨《中国药典》2010版黑顺片的薄层鉴别方法,并进行改进。方法使用单因素试验方法,考察影响黑顺片生物碱薄层层析的因素。结果以正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶乙醇(5.6∶3.4∶1∶1)为展开剂,置氨蒸气饱和20min的层析缸中,在室温下展开12 cm,取出,晾干,喷以稀碘化铋钾溶液,晾干,再喷以碘化碘钾和碘化铋钾的等容混合溶液,检视,斑点清晰,分离度好。结论改进后的薄层鉴别方法效果良好,为药典的修订提供了一定的参考。

黑顺片质量标准研究

目的完善黑顺片质量评价方法,为其质量监控提供参考。方法采用薄层色谱法对不同产地黑顺片进行定性鉴别;参照2015年版《中华人民共和国药典》通则方法测定黑顺片的水分、灰分、浸出物及农药残留;采用滴定法对黑顺片的钙离子含量进行测定。结果不同产地黑顺片薄层色谱斑点清晰,分离度好;拟定黑顺片中水分不得过14.0%,总灰分不得过6.0%,酸不溶灰分不得过1.0%,水溶性浸出物不得少于8.0%,钙离子含量为130~280μmol/g;11批四川江油黑顺片均未检出9种有机氯类农药残留。结论本研究建立的方法专属性强,操作简单,重复性好,可为黑顺片的质量评价提供依据。

采用傅里叶变换红外光谱和HPLC法分析附子炮制品黑顺片和白附片差异

目的基于成分分析探讨黑顺片和白附片的差异。方法基于傅里叶红外光谱(fourier transforms infrared,FTIR)和HPLC,结合化学计量学方法,对黑顺片和白附片的整体化学成分进行研究,并通过独立样本t检验对其有效和毒性成分含量进行比较分析。结果FTIR结合正交偏最小二乘法判别分析(orthogonalpartialleastsquares-discriminationanalysis,OPLS-DA)结果显示,白附片和黑顺片整体化学成分差异明显,饮片类型的差异高于产地差异;HPLC的聚类分析(hierarchical clustering analysis,HCA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)、OPLS-DA和相似度分析(similarity analysis,SA)均能将黑顺片、白附片区分为2类,表明2种饮片的成分差异较大;含量测定结果显示,黑顺片的单酯型生物碱量显著高于白附片,具有统计学意义(P<0.01),而双酯型生物碱含量差异不显著,无统计学意义。结论白附片和黑顺片化学成分差异较大,临床上应区分使用,古代本草“白缓黑急”理论具有一定的合理性。

黑顺片标准汤剂质量标准研究

目的制备黑顺片标准汤剂并研究其质量标准。方法收集不同产地的黑顺片15批,按要求制备标准汤剂,测定其pH值、出膏率、指标性成分的含量,计算转移率,建立指标成分含量测定和指纹图谱方法。结果15批黑顺片标准汤剂的pH值为4.39~5.38,平均4.72±0.25;出膏率为6.89%~24.08%,平均14.93±5.42%;苯甲酰新乌头原碱的转移率为68.12%~103.66%,平均(81.71±9.36)%;苯甲酰乌头原碱的转移率为55.25%~101.89%,平均(68.19±11.11)%;苯甲酰次乌头原碱的转移率为26.28%~97.87%,平均(70.95±18.81)%;指纹图谱共有峰11个,且15批黑顺片标准汤剂指纹图谱与对照指纹图谱相似度均高于0.95。结论制备的黑顺片标准汤剂具有一定的代表性,可为制定黑顺片标准汤剂质量标准提供参考。

黑顺片血浆指纹图谱与抗心衰作用的谱效关系研究

目的探讨ig黑顺片(附子炮制品)醇提物后大鼠血浆指纹图谱与药效指标(血压、心率)间的谱效关系,以阐明附子抗心衰作用的药效物质基础。方法利用UPLC-QTOF/MS建立大鼠ig黑顺片醇提物的血浆指纹图谱,并连续监测心衰大鼠的血压和心率,再用偏最小二乘回归(PLSR)法对黑顺片入血成分指纹峰与药效指标进行相关性分析。结果从黑顺片血浆指纹图谱中筛选出13个入血成分,通过PLSR分析发现次乌头原碱、苯甲酰中乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和3,13-脱氧苯甲酰乌头原碱的血浆药物浓度变化与心率或血压变化呈显著正相关性,且VIP值大于1。结论次乌头原碱、苯甲酰中乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和3,13-脱氧苯甲酰乌头原碱为黑顺片抗心衰作用的潜在药效物质。

黑顺片炮制过程中6种酯型生物碱的变化规律研究

研究黑顺片炮制过程中6种酯型生物碱的变化规律及特征图谱,为黑顺片的炮制原理研究奠定基础。采用Phenomenex Gemini C_(18)柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-40 mmol·L^(-1)醋酸铵(浓氨调pH 10.0)梯度洗脱,流速0.8 mL·min^(-1),检测波长235 nm,进样量10~20μL,测定6种酯型生物碱含量的变化以及建立炮制过程的特征图谱。随着炮制过程的进行,双酯型生物碱含量降低,单酯型生物碱变化规律不明显,各炮制过程环节的7种附子"状态"特征图谱差异明显。特征图谱中共标记13个峰,除6种已知单双酯型生物碱外,其余7个峰峰面积变化趋势与双酯型生物碱的变化趋势一致。该方法准确可靠,重复性好,可为揭示黑顺片炮制过程中指标成分的变化规律以及阐明炮制原理提供参考。

附子煎煮过程中13种生物碱含量的动态变化规律研究

目的：采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱,精确测定附子水煎液中酯型生物碱、原碱、去甲猪毛菜碱等成分的含量,探讨附子煎煮过程中13种生物碱的动态变化规律,为临床应用和炮制提供参考。方法：采用Agilent SB-C18色谱柱（2.1 mm×20 mm,1.8μm）,以2 mmol·L^-1醋酸铵溶液-乙腈为流动相,梯度洗脱,流速0.4 m L·min^-1,柱温35℃;质谱采用ESI＋离子源,多反应监测模式（MRM）,检测13种生物碱（乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、多根乌头碱、宋果灵、去甲猪毛菜碱）以及内标氢溴酸高乌甲素的定量离子和定性离子。结果：生附片煎煮过程中双酯型生物碱（乌头碱、新乌头碱、次乌头碱）含量迅速降低,4 h后趋于稳定且含量很低;单酯型生物碱（苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱）含量先升后降,于4-6 h达到高峰;原碱中乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱含量一直快速增加,而附子灵、宋果灵、多根乌头碱和去甲猪毛菜碱含量缓慢增加,约在4h达到最高峰,后趋于稳定或略有降低。黑顺片煎煮过程中生物碱成分的动态变化趋势与生附片相似,但变化幅度显著小于生附片。结论：生附片煎煮2-4 h,双酯型生物碱含量已很低,能保证临床用药安全,且总生物碱等主要成分的含量显著高于黑顺片水煎液。

附子颗粒制剂成型工艺研究

开发附子颗粒制剂新剂型。采用水提法对黑顺片进行提取,保留提取物的全成分,进行减压浓缩,得浸膏。用UPLC法测定浸膏中乌头类生物碱含量。运用挤压制粒法进行制粒,在单因素试验的基础上,进行正交试验,确定颗粒制剂的最佳工艺条件,并测定主药含量。正交试验进行工艺条件优化,结果为A2B2C1,即主辅比为1︰4(g/m L),β-环糊精为稀释剂,不添加黏合剂。附子颗粒制剂成型工艺条件简单,重复性好,有效成分含量稳定。同时,所得颗粒成型性好,色泽一致,粒度均一,溶解性和流动性符合《药典》要求。