棉铃虫组织蛋白酶B在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

以棉铃虫(helicoverpa armigera)组织蛋白酶B作外源基因重组构建克隆载体,自重组菌株HCB-DH10Bad、Histag-HCB-DH10Bac中提取穿梭质粒,脂质体法转染草地贪夜蛾卵巢细胞系Sf21细胞,转染液再感染细胞,收集感染3～4 d的上清液,提取芽生病毒的DNA,PCR法鉴定外源HCB基因,感染上清进行SDS-PAGE、Western-blotting、蛋白酶活性检测.结果:感染上清中的芽生病毒的DNA作模板扩增出预期的1 700bp片段,SDS-PAGE、Western-blotting检测均在28ku处有明显表达产物,且表达产物有蛋白水解活性.

棉铃虫组织蛋白酶B酶原在毕赤酵母中的表达

棉铃虫组织蛋白酶B(Helicoverpa armigeraCathepsin B,HCB)属于半胱氨酸蛋白酶类,参与胚胎发育中卵黄蛋白水解供给胚胎发育的氨基酸。将HCB基因克隆到pPIC9K载体并转化毕赤酵母KM71菌株,经甲醇诱导,HCB表达并分泌到培养上清中。表达产物经SDS-PAGE测定分子量为38kDa,与HCB基因编码的蛋白质分子量一致。用HCB的特异性抗体检测表明重组表达产物为棉铃虫组织蛋白酶B,原位水解实验显示重组表达的蛋白酶具有蛋白水解活性,表明在毕赤酵母中表达了有活性的棉铃虫组织蛋白酶B,可用于组织蛋白酶B酶原活化机理研究及开发新蛋白酶产品。