HMC毒素诱导玉米同核C、N细胞质细胞凋亡的荧光显微观察

【目的】研究玉米小斑病菌C小种毒素(HMC-toxin)诱导同核异质体玉米的离体根冠细胞发生凋亡的差异性及凋亡规律。【方法】采用吖啶橙(AO)与溴化乙啶(EB)荧光复染以及Hoechst 33258荧光染色的方法检测。【结果】HMC毒素诱导根冠细胞发生凋亡,出现凋亡小体与染色体边集形态特征。在3种毒素浓度、3种处理时间下,Mo17-C的根冠细胞死亡率均高于Mo17-N。采用AO与EB复染方法,在150μg.mL-1HMC毒素处理7 h时,Mo17-C细胞凋亡率达最高值,为68.7%,而Mo17-N仅为29%;经Hoechst 33258染色后,在150μg.mL-1HMC毒素处理下,Mo17-C也于7 h时达最大凋亡率,为57.3%,而Mo17-N为27.7%。【结论】在毒素"伤害"细胞致死过程中,C细胞质的细胞死亡率远高于N细胞质;在"诱导"细胞凋亡程序中,C细胞质的细胞凋亡率也远高于N细胞质的。凋亡率随诱导浓度和诱导时间的增加而增加。AO、EB复染与Hoechst 33258染色相比,两者细胞凋亡率接近,准确度均高,图像清晰,且费用相当,但前者可以区分早期和晚期凋亡细胞而后者不能区分。

HMC-毒素对C型不育玉米根冠细胞原生质体及微丝分布的影响

用玉米小斑病菌C小种毒素 (HMC 毒素 )处理C型不育玉米根冠细胞后 ,采用微丝的特异探针异硫氰酸荧光素 鬼笔环肽进行标记 ,荧光显微镜下发现HMC 毒素可引起根冠细胞原生质体收缩 ,并伴有原生质泄漏、原生质体荧光变暗、微丝分布异常等现象。HMC 毒素对根冠细胞的这种影响明显不同于细胞松弛素B(CB) ;并且与HMC 毒素处理后的同核保持系 (N)玉米相比损坏程度要严重得多 ,N型玉米细胞原生质体只是轻度收缩 ,仍可见微丝网络分布。根冠细胞对HMC

HMC毒素培养滤液对专化寄主玉米叶片诱导抗病性及相关酶的影响

【目的】研究HMC毒素培养滤液对玉米叶片诱导抗病性作用及抗病性相关酶的影响。【方法】以两对同核异质玉米自交系(B37和C103)为试材,采用离体叶片法检测不同稀释倍数的HMC毒素培养滤液对专化寄主玉米叶片的致病性,从中筛选适宜诱导的有效浓度,在诱导中和接种后两个阶段分别测定防御酶活性及与抗病性相关物质含量等生理指标。【结果】不同基因型与不同细胞质玉米都可以利用低浓度HMC毒素培养滤液诱导以增强其抗性;不同处理时期,植物抗病性相关酶活性呈现不同的动态变化;不同的诱导处理均导致抗病性反应的产生,对C细胞质的预处理效果好于N细胞质,且具有浓度效应。【结论】低浓度HMC毒素培养滤液预处理后,刺激了POD、PAL酶活性提高和MDA含量下降,以此来启动玉米本身的防卫系统,因钝化作用而抑制侵染,当再接种高浓度HMC毒素培养滤液后,抗病性相关酶得到了进一步激活,使C细胞质玉米对HMC敏感性降低,从而玉米叶片呈现出抗病性。

HMC毒素对雄性不育玉米线粒体结构和功能的影响

用 HMC毒素处理 C型不育系玉米和同核保持系 ( N)玉米的线粒体 ,透射电镜观察发现 :HMC毒素可使 C细胞质玉米线粒体内膜受到严重破坏 ,嵴消失 ,线粒体变为由外膜围成的空泡状 ;N细胞质大多数线粒体没有受到损伤 ,有的只受到轻微的破坏 ,但内膜仍可见。用氧电极测定线粒体的呼吸控制值 ( RCR)和氧化磷酸化效率 ( P/O) ,结果表明 :HMC毒素的加入可使 C细胞质玉米叶片的线粒体的 RCR下降等于或大于 2 0 % ,加毒素后再加 ADP,耗氧曲线不能进入状态 呼吸 ,线粒体的呼吸保持在 态 ,表明毒素处理后 ADP几乎没有被消耗 ,出现类似氧化磷酸化解偶联现象 ,P/O由于 ADP没有被消耗而趋于零 ;N细胞质玉米叶片的线粒体的 RCR下降等于或小于 5 % ,P/O变化很小。可见 ,HMC毒素对 C型不育玉米线粒体的内膜结构和氧化磷酸化功能均表现专化毒害作用。

HMC毒素引起玉米根冠活细胞凋亡的荧光显微观察

采用根冠细胞测定法,以玉米小斑病菌C小种毒素(HMC-toxin)处理基因型为B37的同核异质体(Homo-caryon)雄不育C细胞质和正常N细胞质玉米的根冠离体细胞后,采用吖啶橙荧光染色,荧光显微镜下发现HMC毒素可引起细胞凋亡,C细胞质中的凋亡细胞,多于N细胞质中的凋亡细胞,在对照中未观察到凋亡现象。还记载了玉米根冠细胞凋亡的具体过程。

HMC毒素诱导玉米专效寄主原生质体细胞凋亡的检测

以2对同核异质玉米B37和Mo17叶片的原生质体为试材,并将原生质体随机分为4组,HMC毒素质量浓度分别为0、50、100、150μg/mL,处理时间分别为1、3、6h。采用吖啶橙(AO)与溴化乙啶(EB)荧光复染的方法进行检测,观察处理后原生质体的凋亡特征及细胞凋亡率的变化趋势。结果表明:HMC毒素处理玉米原生质体后发生细胞凋亡,并出现凋亡小体、染色质边集或环状染色质等凋亡特征;经不同浓度HMC毒素处理B37和Mo17玉米原生质体,CB37的最大凋亡率为10.80%,NB37为4.90%,CMo17为21.00%,NMo17为8.83%;HMC毒素对2种基因型的C、N细胞质所测结果一致,均为C细胞质对毒素敏感,先出现细胞凋亡,N细胞质出现细胞凋亡的时间相对较晚;C、N之间的细胞凋亡率差异显著,且前者高于后者。当毒素浓度不变时,细胞凋亡率随毒素处理时间的延长而递增;当处理时间不变时,细胞凋亡率随毒素浓度的增加而上升。

HMC毒素诱导玉米同核异质B37原生质体细胞凋亡的检测

以B37-C和B37-N的玉米原生质体和叶片为试材,研究HMC毒素对两种同核异质玉米B37细胞凋亡的诱导作用。经Hoechst33258荧光染色表明:HMC毒素处理后的玉米原生质体均出现细胞凋亡现象,在荧光显微镜下可观察到凋亡小体、染色质边集或环状染色质等凋亡特征。原生质体的细胞凋亡率,B37的C细胞质显著高于N细胞质玉米,且凋亡率随处理浓度和处理时间的增加而上升。用HMC毒素处理玉米叶片,明显出现DNA-ladder现象时所需的毒素浓度C、N两种细胞质均为200μg/mL;但C细胞质所需的时间为6 h,而N细胞质则需9 h。用荧光显微观察与凝胶电泳分析所获得的结果一致,均表现出C细胞质对毒素较为敏感,先出现细胞凋亡;N细胞质对毒素的敏感性低于C细胞质,出现细胞凋亡的时间较晚。

HMC毒素处理诱导玉米幼苗根冠细胞凋亡的结果观察

以玉米小斑病菌C小种毒素(HMC-toxin)分别诱导2对同核异质体玉米的幼苗根冠细胞(即:基因型为B37的玉米C型不育细胞质CB37和同核保持系NB37,基因型为Mo17的玉米C型不育细胞质CMo17和同核保持系NMo17),采用吖啶橙(AO)与溴化乙啶(EB)荧光复染的方法,研究细胞发生凋亡的差异性及凋亡规律。结果表明:CB37的幼叶接种PBS再经150mg/L的HMC毒素处理后,其根冠细胞凋亡率达最高值为45.3%,而NB37仅为15.3%;CMo17凋亡率最高达63.7%,NMo17仅为6.39%;C细胞质的细胞死亡率远高于N细胞质,凋亡率随诱导浓度和诱导时间的增加而增加。HMC毒素诱导根冠细胞发生凋亡,活细胞核发出绿色荧光,坏死细胞核则呈现橙红色荧光,且细胞核呈松散的颗粒状或新月状,凋亡细胞则发出黄绿色或绿色荧光,染色体固缩成新月状或颗粒状。

玉米小斑病菌C小种毒素诱导玉米离体根冠细胞凋亡的检测

将玉米同核异质体不育细胞质CB37及其正常保持系NB37的离体根冠细胞分为4组,其中3组分别用质量浓度50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL的玉米小斑病菌C小种(HMC)毒素诱导,1组用pH6.5PBS诱导作为对照,诱导时间分别为1h、4h和7h。然后采用中性红与伊文思蓝染色、吖啶橙(AO)与溴化乙啶(EB)复染和Hoechst33258染色3种方法检测玉米根冠细胞的凋亡状况。结果表明:HMC毒素诱导玉米根冠细胞发生凋亡,并出现凋亡小体与染色体边集形态特征。中性红与伊文思蓝染色,只能检测出活细胞和死细胞,且在3种毒素浓度、3种处理时间下,CB37的根冠细胞死亡率均高于NB37;采用AO与EB复染方法,用150μg/mLHMC毒素处理7h时,CB37细胞凋亡率达到最高值70.2%,而NB37仅为36.7%;经Hoechst33258染色后,CB37用150μg/mLHMC毒素处理7h时达到最大凋亡率为74.5%,而NB37为30.7%。专效性HMC毒素对C细胞质敏感,在毒素伤害细胞致死过程中,C细胞质的细胞死亡率远高于N细胞质;在诱导细胞凋亡程序中,C细胞质的细胞凋亡率也远高于N细胞质,且其凋亡率随诱导质量浓度和诱导时间的增加而增加;AO、EB复染与Hoechst33258染色两者相比,细胞凋亡率接近,准确度均高,图像清晰,且费用相当,但前者可以区分早期和晚期凋亡细胞,而后者不能区分。

低浓度玉米小斑病菌C小种毒素培养滤液对玉米叶片过氧化物酶活性的诱导作用

分别用不同低浓度玉米小斑病菌C小种毒素培养滤液处理两种基因型(C103和B37)的同核异质系的玉米叶片,以提高玉米叶片内过氧化物酶(POD)的活性;结果说明:过氧化物酶的活性变化与植物抗病性呈正相关,低浓度C毒素培养滤液本身能够作为激发子来诱导玉米获得抗性,故低浓度C毒素培养滤液作为激发子来诱导玉米的系统获得性抗性具有一定的广适性。对CB37和CC103的处理中,1∶60处理组效果均表现为较好,POD酶活性最高。

低浓度玉米小斑病菌C小种毒素培养滤液诱导寄主抗性的研究

利用低浓度玉米小斑病菌C小种毒素培养滤液作为激发子诱导玉米获得抗病性。以一对同核异质玉米B37自交系为试材,采用离体叶片接种法检测适宜诱导抗性的低浓度玉米小斑病菌C小种毒素培养滤液作为激发子诱导玉米抗病性的适宜诱导浓度,测定与抗病性相关酶的变化。经用1∶50和1∶60的低浓度玉米小斑病菌C小种毒素培养滤液预处理植株,再接种高浓度（1∶10）毒素培养滤液处理的病斑面积分别为（0.30±0.14）和（0.36±0.17）mm2,而对照为（2.70±0.24）mm2,是处理的7.5-9倍,差异极显著。经0-72 h的动态检测,以1∶60预处理效果为最佳,与对照相比,苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性平均提高了23.4%,过氧化物酶（POD）活性平均提高了65.9%,有害物质丙二醛（MDA）的含量平均降低了28.2%。叶片内部所产生的生化反应与叶片表面的抗性病理反应相吻合,证实低浓度玉米小斑病菌C小种毒素滤液本身能够成功地作为激发子来诱导寄主-玉米获得抗性。

玉米离体根冠细胞凋亡的荧光显微观察(简报)

1969年Smedegard-Petersen和Nelson首次报道玉米小斑病菌毒素（Helminthosporium maydis toxin,简称Hm-毒素）时曾利用抑制种子根生长法和离体叶片法对Hm-毒素进行生物测定。以后Lim等人在小斑病菌T小种毒素（简称HMT毒素）的研究中提出了抑制根伸长法在抗病性鉴定和选育抗病品种方面有应用价值。但是，抑制根伸长法受种子个体间生活力差异的影响较大，不够理想，加上不同毒素制剂之间结果的差异大，在实际应用中存在很大困难。1982年，

不同荧光染色方法检测HMC毒素诱导处理玉米B37根冠细胞凋亡

采用吖啶橙(AO)与溴化乙啶(EB)荧光双染色以及Hoechst 33258荧光染色法对HMC毒素诱导玉米B37-C、B37-N根冠细胞凋亡率进行检测。结果表明,采用AO/EB双染色后,当HMC毒素浓度为50、100、150μg/mL,处理7 h时B37-C根冠细胞凋亡率分别为24.8%、58.2%、70.2%,B37-N仅为11.0%、25.7%和36.6%;当浓度为150μg/mL,处理时间4 h时B37-C根冠细胞最大凋亡率为62.3%,B37-N为25.8%。经Hoechst 33258染色后,HMC毒素浓度为50、100、150μg/mL,处理7 h时B37-C的根冠细胞凋亡率分别为32.5%、58.7%、74.5%,B37-N仅为7.5%、22.3%和30.7%;HMC毒素浓度为150μg/mL,处理4 h时B37-C的细胞凋亡率为62.3%,B37-N为19.3%。

玉米小斑病菌毒素诱导自交系Mo17凋亡的检测

利用提取的玉米小斑病菌C小种(Helminthosporium maydis race C,HMC)毒素处理同核异质体Mo17-C和Mo17-N叶片及叶片中的原生质体并进行凋亡检测。叶片凋亡检测采用DNA凝胶电泳分析,结果表明:Mo17-C和Mo17-N均出现DNA-ladder,其中HMC毒素质量浓度为250μg/mL时,诱导12 h后Mo17-C出现的DNA-ladder最明显,而Mo17-N在HMC毒素质量浓度升至300μg/mL时,诱导12 h后DNA-ladder才最明显。原生质体的凋亡检测采用Hoechst 33258荧光染色法并统计其凋亡率,结果表明:Mo17-C和Mo17-N均出现细胞凋亡的特征,包括产生凋亡小体、环状染色质和染色质边集的现象,且凋亡率均随毒素浓度的增加和诱导时间的延长而呈上升趋势。但对于相同处理,C细胞质的凋亡率显著高于N细胞质,Mo17-C对HMC毒素的敏感性大于Mo17-N。

利用荧光探针和激光共聚焦显微镜显示玉米根冠细胞微丝分布与变化

利用罗丹明标记的鬼笔环肽为荧光探针,通过激光共聚焦荧光显微镜,观察了玉米根冠细胞中微丝的分布与变化。结果显示:脱落的玉米根冠细胞中存在微丝网络,纤细的微丝相互交织,并与荧光颗粒交叉相连,其中在细胞核、质体等细胞器周围较密集,可见放射状微丝束,暗示微丝的功能与细胞核、细胞器的活动相关。细胞松弛素B可破坏微丝分布;来自玉米小斑病菌C小种的致病毒素对微丝网络也有专化破坏作用,并且它们对微丝的破坏作用随着浓度的增大而加强。

玉米小斑病菌复壮培养基的筛选

选用7种培养基对出现退化的玉米小斑病菌进行复壮培养。结果显示:通过V8培养基和玉米苗浸汁培养基获得的复壮菌株,菌落形态表现为菌丝黑密粗壮,且生长速度(分别为6.46 mm/d和6.33 mm/d)、产孢量(分别为2.72×106个/mL和1.92×106个/mL)和致病力等均得到恢复与提高。复壮后的病毒粗提液,对C和N细胞质产生较强的专效性毒害,反映出对菌株复壮的高度有效性。

三种玉米小斑病菌毒素活性检测方法比较研究

利用3种不同的毒素活性检测方法 (离体叶片针刺法、根冠细胞染色法和游离原生质体染色法)检测玉米小斑病菌C小种(HMC)的毒素生物活性,比较其检测效果,用以探讨HMC毒素致病机理。结果表明:离体叶片针刺法虽能简便地测出毒素的活性,但不能做定量分析,仅从宏观上检测出病斑的形成。根冠细胞染色法,不仅定性还可定量分析毒素的活性。游离原生质体染色法,对HMC毒素活性的测定,虽同样准确可靠,但其费用较高。相较而言,根冠细胞染色法对玉米小斑病菌的抗性鉴定是一种简便、快捷、实用的检测方法,且能快速筛选出抗病体,为加速抗病育种提供资源基础。