乌苏里江唇(Hemibarbus labeo Pallas)的细胞遗传学分析

采用体内注射PHA和秋水仙素、肾细胞短期培养、常规空气干燥方法,制备乌苏里江唇的染色体。对其肾细胞染色体数目统计分析结果表明,乌苏里江唇的染色体数染色体组有50条染色体,8对中部着丝点染色体(m),8对亚中部着丝点染色体(sm),9对端部着丝点染色体和亚端部着丝点染色体(st,t),其染色体臂数(NF)为82。乌苏里江唇组型公式为2n=16m+16sm+18st+t。采用流式细胞分析仪,测定了乌苏里江唇的DNA含量,与鸡血细胞标准对照相比为1.02±0.10,以鸡红细胞DNA含量2.3 pg.N-1计,则乌苏里江唇的体细胞DNA含量为2.34 pg.N-1。与鲤形目其他科的二倍体鱼类比较,乌苏里江唇染色体数目和DNA含量相互对应,共同体现出二倍体特征。

鸭绿江重唇鱼(Hemibarbus labeo)繁殖生物学研究

重唇鱼[Hemibarbus labeo（Pallas）]分布于全国各主要水系,是鸭绿江重要的名贵经济鱼类。近年来由于乱捕、生态环境恶化等,重唇鱼资源遭到破坏。研究其生殖生物学特征,可以了解其种群动态,对其种群保护和资源恢复有参考依据。2012年5月至2013年12月在鸭绿江吉林江段对重唇鱼的繁殖生物学进行了研究。测量了卵径大小在0.8~1.7 mm之间,成熟卵径在1.3~1.5 mm之间,且卵径分布仅有此一个高峰;测定了鸭绿江重唇鱼的初次性成熟全长;全年性腺发育特征;卵巢组成、绝对繁殖力和相对繁殖力,通过肝脏指数和性腺指数的变化,分析鸭绿江重唇鱼性腺发育周期的营养需要。

唇鱼骨、花鱼骨及其杂交F_1的形态差异分析

运用3种多元分析法分析了唇鱼骨Hemibarbus labeo、花鱼骨H.maculates及其杂交F1(唇鱼骨♀×花鱼骨♂)的形态差异。结果表明:杂交F1在体形和体色上完全偏向于母本唇鱼骨,仅背部的小黑点是继承了花鱼骨的形态特征;唇鱼骨、花鱼骨和杂交种F1的可数性状中背鳍、臀鳍、胸鳍和腹鳍条数基本上一致,各项差异均不显著。利用主成分分析构建了9个主成分,对总变异的累积贡献率为80.8%。聚类分析结果表明,杂交F1的形态与唇鱼骨形态较为相似。采用逐步判别分析方法建立了3种鱼的判别函数,判别准确率分别为86.7%～100%(P1)、87.9%～100%(P2),综合判别率为94.4%。

乌苏里江唇鱼骨的全人工繁育

从乌苏里江捕获野生唇鱼骨(Hemibarbus labeo)亲鱼150余尾,经人工繁殖获得鱼苗,饲养于池塘中,研究其在人工养殖条件下的生长、繁殖和性腺发育等生物学特性。结果表明,野生亲鱼及其F1在池塘中饲养下,性腺可自然发育至成熟,繁殖季节(5-6月)雌、雄亲鱼会出现明显的副性征,注射催产激素HCG、LRH-A2和DOM的混合制剂,可促使成熟的雌性亲鱼产卵,水温22～26℃时,药物的效应时间在17～22h,人工繁殖的催产率、受精率、孵化率和畸形率分别为87.55%、68.95%、92.5%和5.75%。唇鱼骨的卵为圆形、灰白色或淡绿色,遇水后产生较强的黏性,吸水膨胀卵径为(2.32±0.12)mm(n=50),体质量400～900g的雌性亲鱼绝对怀卵量为(3.19±0.85)×104粒(n=15)。水温22～24℃时,从卵授精到仔鱼孵出需要积温69.43℃·d,到仔鱼平游摄食需要积温139.25℃·d,刚出膜的仔鱼全长(6.1±0.3)mm,平游时全长达到(8.9±0.4)mm。在哈尔滨地区人工池塘养殖唇鱼骨,1+龄鱼体质量为(17.20±2.46)g,2+龄鱼为(89.84±9.30)g,3+龄鱼为(234.94±25.94)g,4+龄鱼为(371.57±64.65)g;雄性3+、雌性4+有部分个体性腺成熟,5+龄时多数个体可发育至性成熟。唇鱼骨的全人工繁育成功,可初步解决苗种来源和池塘养殖问题,并为野生资源的增殖和人工规模化养殖奠定基础。

唇人工繁殖和鱼苗培育初步研究

对唇（鱼骨）（Hemibarbus labeo）的亲鱼培育、人工繁殖、孵化和鱼苗培育等技术进行了初步研究。试验结果表明：唇鳕野生亲本在池塘条件下经人工驯养可达性成熟；在水温19．0～21．0℃时一次性注射LHR—A2、HCG和DOM混合催产剂，其效应时间18～21．5h；2005～2006年采用人工催产、自然产卵及人工授精、流水孵化、豆浆法培育鱼苗等方法，共催产雌鱼44尾，平均催产率81．5％，共计产卵45．7万粒，平均受精率82．6％，孵化率77．4％，共孵出鱼苗24．5万尾。鱼苗经25～30d豆浆法培育后可达3cmI；2_L，平均成活率为65．5％，共培育夏花15．1万尾。

花和唇的含肉率及肌肉营养成分分析

利用国内外通用的营养测试方法测定了花(Hemibarbus maculates)和唇(Hemibarbu labeo)的含肉率和肌肉营养成分。结果表明:花和唇含肉率分别是70.61%7、1.52%;花肌肉(鲜样)中蛋白质(18.41%)和脂肪含量(2.46%)显著高于唇的,而花的灰分含量要显著低于唇;水分含量分别是78.35%、78.51%,两者无显著差异。花和唇肌肉中脂肪酸种类丰富,饱和脂肪酸(SFA)4种,不饱和脂肪酸(UFA)7种;其中单不饱和脂肪酸(MUFA)4种,多不饱和脂肪酸(PUFA)3种;其中DHA含量高达5.00%和14.32%。花和唇肌肉中的氨基酸总量分别是63.07%和67.63%,呈味氨基酸分别为25.96%和26.30%。缬氨酸、蛋氨酸和胱氨酸为限制性氨基酸。

野生和池塘养殖花鱼骨肌肉营养组成的比较分析

通过对野生花鱼骨和池养花鱼骨肌肉中常规营养组成、18种氨基酸含量及脂肪酸组成的比较分析。结果表明,野生鱼肌肉的水分及灰分含量显著高于池养鱼,而粗脂肪含量显著低于池养鱼(P<0.05),两者粗蛋白含量无显著差异(P>0.05);两者肌肉中氨基酸的含量,除胱氨酸外的其余17种氨基酸的含量无显著差异(P>0.05);野生鱼肌肉脂肪酸组成中,饱和脂肪酸总量和多烯酸总量的百分比显著高于池养鱼,单烯酸总量的百分比显著低于池养鱼(P<0.05)。在多烯酸中,野生鱼的C18∶2、C18∶3和C20∶2占脂肪酸总量的百分比显著低于池养鱼,而C20∶3、C20∶4、C20∶5、C22∶4、C22∶5、C22∶6、Σn-6及Σn-3占脂肪酸总量的百分比显著高于池养鱼(P<0.05)。但池塘养殖花鱼骨单位重量肌肉组织所含的人体所需必需脂肪酸的量,除EPA略低外,n-6系列PUFA总和、n-3系列PUFA总和及DHA均高于野生鱼。

乌苏里江唇的鳞片和生长特征

依据238尾鱼的测量数值,研究了乌苏里江野生唇(Hemibarbuslabeo)的鳞片及生长特征,并调查了乌苏里江抓吉镇江段唇的捕捞资源情况。结果表明,唇的鳞片较大,为规则圆鳞,年轮特征清晰,易于分辨,鳞径(R鳞径)与生长时间(年龄t)的回归方程为R鳞径=0.8583t+2.275(n=238,r=0.9868),体长与鳞径的回归方程为L=4.3326R鳞径+0.0293(n=238,r=0.9903)。乌苏里江唇体重与体长的回归方程为W=0.0115L3.0868(n=238,r=0.9962),其生长特征适合VonBertalanffy生长方程,体重的生长拐点t=4.59龄,W=340.90g。在乌苏里江抓吉镇江段主要捕捞唇的时间从每年开冰期4月20日到封冰期11月15日左右,其捕捞量随季节的变化而不同,4～5月、10～11月数量最多,为100～150kg/d,6～7月为50～100kg/d,8～9月较少,为30～40kg/d。

基于线粒体Cyt b基因的中国南方唇(Hermibarbus labeo)和间(Hermibarbus medius)种群分化及亲缘地理研究

为了解中国南方唇(Hermibarbus labeo)和间(Hermibarbus medius)的种群分化、亲缘地理格局及物种有效性,作者对唇8个水系及间9个水系共148尾样本的Cyt b基因全序列进行了测定。在所有序列中,共有128个变异位点,共检测出了41个单倍型,单倍型多样性为0.954,核苷酸多样性为0.02153。基于Cyt b基因全序列构建的NJ树显示,中国南方的唇与间合聚为两大支,其中韩江和九龙江的全部唇样本组成了Ⅰ支,而其他水系的唇和间样本则组成了Ⅱ支。两支系间的遗传距离为5.1%,而唇和间之间的遗传距离为3.2%。现有证据不支持间与唇达到种一级的分化。单倍型网络图显示,韩江、九龙江种群和其他水系的种群分化较大;海南岛三大水系种群和漠阳江种群的单倍型分支与代表珠江水系单倍型的分支之间的亲缘关系较近,与其他地理区间种群的亲缘关系则相对较远;西江可能为珠江水系、漠阳江水系和海南岛三大水系间种群的扩散中心,其中一支往东向北江和东江扩散;另一支往南向海南岛扩散,海南岛三大水系种群尔后在冰期海退时向北扩散至漠阳江水系及珠江水系。AMOVA分析表明,唇和间地理区之间变异约占54.50%,地理区内种群间变异约占18.64%,种群内的变异占26.86%,这说明,唇和间种群Cyt b的遗传分化主要是来自地理区之间。错配分析及中性检验显示,全部种群、唇种群、间种群在历史上均没有发生过明显的扩张,两个mt DNA支系亦未发生过扩张,而海南岛的昌化江种群曾发生过种群扩张。

黑龙江和乌苏里江唇的微卫星引物筛选及群体遗传结构

利用鲤(Cyprinus carpioL.)(20对引物)和Hemibarbus mylodon(21对引物)共41对微卫星引物对黑龙江(逊克,XK)和乌苏里江(虎头,HT;海青,HQ)的3个野生唇(Hemibarbus labeo)群体进行引物适合性研究,并将获得的多态性微卫星位点用于唇群体遗传结构分析。引物筛选结果表明,5对鲤引物可对唇扩增出条带,但产物均无多态性;11对H.mylodon引物能在唇中成功扩增,10对引物(10个位点)的扩增产物具有多态性,其中7个位点为高度多态(PIC>0.5)。对3个唇群体进行遗传多样性分析,结果显示10个位点的平均杂合度为0.4834,共检测到96个等位基因(40个有效等位基因),以HT群体的遗传变异水平最高。卡方检验结果表明,8个位点在3个群体中不同程度地偏离遗传平衡(P<0.05),且偏离平衡的位点均表现为杂合体缺失(Fis>0)。3个群体两两间具有较多的基因交流(Nm>11),以XK和HQ间最高(17.27),二者的遗传距离也最近(0.0497),群体间的遗传分化微弱(Fst=0.0236)。以上结果表明,H.mylodon的微卫星引物适合于唇的群体遗传变异研究。黑龙江和乌苏里江的野生唇资源受人为及环境因素的影响较大;3个群体间的遗传分化不明显,乌苏里江的HT群体更适合在人工繁殖计划中利用。

根据mtDNA控制区序列分析野生唇的种群遗传结构

为了掌握不同地理种群唇(Hemibarbu labeo)的遗传多样性和遗传结构,探讨其亲缘地理演化过程,研究分析了乌苏里江、长江、黑龙江、鸭绿江和牡丹江5大水系,8个地理群体(n=42)的mtDNA控制区404 bp片段的变异,该片段共有26个变异位点,变异率为6.43%,平均核苷酸多样性为0.011 5。42尾样本共检测到18个单倍型,这8个地理群体是以HT1和HT2单倍型为中心向外辐射演化的。AMOVA分析结果表明,群体内变异为59.29%,同一水系群体间变异为23.50%,不同水系群体间变异为17.20%,以上变异均达到显著水平(P<0.05),群体间配对FST分析结果表明,同一水系内有些群体间差异也达到了显著水平。聚类分析发现,最大简约法(MP)和最大似然率法(ML)结果基本一致,嘉荫群体(HRJY)和四川群体(YRSC)绝大部分个体被聚在一支,鸭绿江群体(YRLJ)聚在一支,这与单倍型网络的分析结果一致,以上结果表明唇的遗传多样较为丰富,黑龙江流域的唇保持了祖先单倍型,其他地理群体为黑龙江流域内群体向不同方向演化的结果,并且部分地理群体已经形成了特有的单倍型。

印染废水对3种水生生物的毒性作用

为合理评估印染废水对水环境造成的影响,以斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、大型溞(Daphnia magna)和太湖花(Hemibarbus maculates)为受试生物,印染废水分别用标准稀释液7346-2按照几何级数稀释成为100.00%、50.00%、25.00%、12.50%和6.25%的系列试验液,研究印染废水对3种水生生物的毒性效应。结果表明,印染废水对水生态系统中不同营养层次的3种生物均有一定的毒性,对斜生栅藻24、48 h的半数生长抑制浓度(EC50)分别为(51.55±4.12)%、(20.40±6.27)%,对大型溞24、48 h的EC50分别为(78.20±4.31)%、(53.10±1.88)%,对花卵裂期胚胎、囊胚期胚胎、原肠期胚胎、初孵仔鱼和25日龄仔鱼96 h的半数致死浓度(LC50)分别为(19.89±1.68)%、(25.95±2.14)%、(27.24±0.88)%、(19.61±2.21)%和(49.27±3.27)%。研究得出印染废水对水生生物的安全浓度为1.96%,生产中应严格控制其排放。

温度对花(鱼骨)耗氧率和排氨率的影响

实验研究了不同水温(10℃,15℃,20℃,25℃)对三种不同规格花(?)的耗氧率和排氨率的影响并阐述了花(?)耗氧和排氨对水质的影响．实验结果表明:体重、温度对其耗氧率和排氨率有极显著的影响,而体重和温度的综合效应对其耗氧率和排氨率没有显著影响;在实验室条件下,花(?)的耗氧率(RO)和排氨率(RN)与体重(W)之间的回归关系分别符合幂函数方程RO=aWb和RN=cWd,在10-25℃温度范同内,不同规格花(?)的耗氧率和排氨率随着温度的升高而增大,随花(?)体重的增加而减少;耗氧率和排氨率与温度(T)、体重(W)的二元线性回归方程分别为:RO:0．008 T+0．022W- 0.003、RN=16．7T+0．741W-0．44,复相关系数分别是r=0．967和r=0．937,F检验表明,两个回归方程均极显著;耗氧率(RO)与排氨率(RN)的比值(O:N)为10．31-28．08,说明花(?)主要以蛋白质和脂肪作为能源物质．

唇受精的细胞学研究

唇精孔器属深凹陷、短孔径型。精子在受精后2s到达精孔管、5s进入卵子。受精后8—15min,卵子进入第二次减数分裂后期。受精后10min,开始形成雄性原核。受精后20min,进入第二次减数分裂末期。受精后25min,雌性原核形成。受精后30—35min,雌性原核向雄性原核移动。受精后40min,雌雄原核接近。受精后50min,雌雄原核结合。受精后70min,受精卵进入第一次有丝分裂中期,受精后80min,进入第一次有丝分裂后期,受精后120min,进入末期。卵黄降解与其内部或外周小泡的泡状缺口紧密相关。雌雄原核结合是精子星光扩张、牵引和细胞质流动的共同结果。有多精入卵的现象。

花的生物学特性和人工繁殖初步研究

2001年6月～2003年5月在浙江海洋学院杭州苗种基地,进行了花?的池塘人工培育亲鱼试验,结果表明:花?当年能够长到20～100g,第二年能长到150～250g的商品鱼,二足龄后,性腺成熟,雌鱼性腺发育达第Ⅳ期,雄鱼性腺发育达第Ⅴ期,怀卵量一般为3～10万粒/尾,可作为亲鱼进行人工繁殖。

花(♀)×唇(♂)杂交子一代胚胎发育研究

采用人工催产和干法授精技术,在ZOOM645S解剖镜下对花(Hemibarbus maculatus)(♀)×唇(H.labeo)(♂)杂交子一代(F1)胚胎发育过程中各发育时期的发育时序和形态特征进行了观察。结果表明,受精卵为强黏性卵,卵径为1.60～1.80 mm。在孵化水温为(20±1)℃条件下,受精后1 h胚盘隆起;1 h20 min进入卵裂期;6 h 20 min进入桑椹期;8 h 20 min进入囊胚期;13 h 10 min进入原肠期;16 h 20min进入神经胚期;受精后18 h进入胚孔封闭期;21 h 30 min进入肌节出现期;27 h 20 min进入眼基出现期;28 h 40 min进入眼囊期;30 h 40 min进入尾芽期;32 h 30 min进入晶体出现期;34 h 40 min进入肌肉效应期;36 h 40 min进入耳石出现期;44 h进入心跳期;53 h 40 min进入眼色素形成期;60 h 40min进入血液循环期;68 h 30 min后开始出膜。杂交F1胚胎发育时序及形态特征均偏向母本花。

RAPD标记在唇与花种质鉴定中的应用

利用RAPD分子标记技术对浙江瓯江溪水性鱼类唇和花进行了种质鉴定和遗传分析,从40个10碱基随机引物中筛选出14个多态性高的引物,分别扩增出130条和127条DNA带,多态位点比率达84.62%和66.93%,平均每个引物扩增多态性带9.3条和9.1条.Shannon多样性指数为0.451 5和0.354 8,Nei s指数为0.303 7和0.239 2.唇和花群体间的平均遗传距离为0.288 0和0.209 6.引物S383、S399、S463和S471扩增的6个特异性标记,可用来区分唇和花.最后应用UPMGA法对它们进行了聚类分析.结果表明唇和花的群体遗传多样性较高,存在较大的遗传变异.RAPD分子标记技术可以方便地应用于属鱼类的种质鉴定.

花的两性异形和雌体繁殖输出

测定了花成体的两性异形和雌体繁殖输出。结果表明,两性成体的体长差异不显著。特定体长的怀卵雌性个体的体高显著大于产后雌体和成年雄体,产后雌体的头宽、头高、尾柄长、尾柄高大于怀卵雌性和成年雄性,产后雌体的尾鳍长、腹鳍臀鳍间距则相对较小,其它局部形态特征不存在显著的两性差异。主成分分析(Eigenvalue≥1)发现,前三个主成分共解释57.7%的变异。头长、腹鳍基前距在第一主成分有较高的正负载系数,头宽、尾柄长、尾柄高在第二主成分有较高的正负载系数,眼间距在第三主成分有较高的正负载系数。第一和第二主成分分值的组间差异显著,第三主成分分值组间差异不显著。花雌体通过个体大小的增加和腹部形态的改变增加繁殖输出。

饲料中蛋白质含量对花生长和消化的影响

在水温（22±3）℃下，将体重5．90g的花[鱼骨]Hemibarbus maculatus放养在网箱（60cm×60cm×120cm）中，投喂蛋白质含量分别为25．0％、31．0％、37．0％、43．0％、49．0％（质量分数，下同）的5种饲料，饲养100d。结果表明：饲料中蛋白质含量为33．42％-38．79％时，鱼的特定生长率和蛋白质效率最高，饲料系数最低（P〈0．05）；蛋白质的含量从25．0％升到37．0％时，鱼肌肉中蛋白质含量（53．18％升到57．97％）达最大值；当饲料中蛋白质含量从25．0％升到31．0％时，鱼肌肉中脂肪含量（14．36％升至17．10％）达最大值；当饲料蛋白质含量为49．0％时，鱼肌肉中蛋白质（54．14％）和脂肪（15．37％）含量降低。当饲料中蛋白质含量由25．0％升到37．0％和43．0％时，肠道中脂肪酶和蛋白酶的活性先升高，后降低；而饲料中蛋白质含量对肠道淀粉酶活性的影响不显著（P〉0．05）。花[鱼骨]由鱼种至食用鱼阶段，饲料中蛋白质含量为38．79％-33．42％较适宜。

瓯江2种的ISSR分析优化和自然种群遗传多样性的研究

以唇和花为材料,对影响PCR反应的主要因子-模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+、Taq酶浓度进行优化,建立了适合唇和花基因组DNA的ISSR-PCR反应体系。25μL的PCR反应液含有的组分和终浓度分别为:约60ng模板DNA、1.2UTaq酶、0.4μmol/L引物、2.0mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、2%甲酰胺。利用优化反应体系从60个ISSR引物中,筛选出18个稳定性高、重复性好的引物,对25个唇个体和22个花个体的DNA进行正式扩增,分别从两个种群分别扩增到168和156条扩增谱带,扩增片段长度在200—1500bp之间。根据扩增结果计算出两个种群的多态位点比例分别为67.52%和53.21%,Shannon多样性指数分别为0.3450和0.2749,Nei’s指数分别为0.2292和0.1837,平均有效等位基因数分别为1.3875和1.3169。两个种群内样本间的平均遗传距离分别为0.2129和0.1529,结果表明两个种群的遗传多态性较高,其中唇的多样性明显高于花群体。引物UBC845扩增的610bp带和UBC854扩增的1240bp带为唇种的特异性谱带。属鱼类基因组中均含有微卫星DNA序列:(AG)8、(GA)8、(CT)8和(GAA)6。本研究为唇和花的种质保护、合理开发利用以及选择育种提供了一些基础数据。