逆转录-半套式聚合酶链反应检测汉坦病毒RNA及其临床初步应用

目的：建立可用于汉坦病毒检测的ＲＴ－ＰＣＲ方法，并对其临床应用进行初步研究．方法：比较７６－１１８株和ＳＲ－１１株Ｓ基因序列，选择其保守区设计半套式引物，通过病毒培养上清及患者血清的扩增检测进行ＰＣＲ方法的敏感性、特异性及临床应用研究．结果：所建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法可检出１．２５ＰＦＵ的病毒量；对照组（正常细胞培养上清和正常人血清）经扩增检测均为阴性；８６份经ＩＦＡ检测抗ＨＶ－ＩｇＭ阳性的肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）患者血清，其阳性检出率按发病时间分别为：１ｗｋ内１００％；１ｗｋ～２ｗｋ６１．２９％；２ｗｋ～３ｗｋ３．３％；＞３ｗｋ为２８．５％．另外２０份ＩＦＡ（－）但疑诊ＨＦＲＳ的初入院患者血清的检出率为３０％，经进一步跟踪观察，确认为ＨＦＲＳ．结论：ＲＴ－ＰＣＲ是一种敏感、特异的ＨＦＲＳ诊断方法，可弥补血清学检测的不足，值得进一步完善、推广和应用．

湖北省不同地区汉坦病毒的基因型研究

目的 对分离自湖北省不同地区的 30株汉坦病毒 (HV)RNAM片段进行分析 ,以了解湖北省不同地区HV的基因特征及基因组功能。方法 参考HV的基因文库软件设计M片段G1 区型特异性引物 ,用适合于湖北省HV分型的逆转录 -半巢式聚合酶链反应 (RT -heminestedPCR) ,并结合限制性内切酶酶切图谱分析 ,对湖北省不同地区分离的 30株HV进行分型、酶切。结果 分离于湖北省不同地区的 30株HV的分型结果为汉滩型 2 1株、汉城型 9株。 2 1株汉滩型靶基因被HinfⅠ、HaeⅢ消化的图形与标准株 76/ 1 1 8株的图形一致 ,未见与H - 1 1 4株相似的图形 ,其中武汉和洪湖各有l株靶基因HaeⅢ消化只见 1个片段 ;应城、江夏、黄陂和麻城各有 1株靶基因HinfⅠ消化有 3个片段。另外 2 1株汉滩型靶基因除前述的应城毒株外均被HincⅡ消化。 9株汉城型靶基因不能被HaeⅢ消化 ;HinfⅠ消化只见 2个片段 ,而EcoRⅠ消化却见 2个片段 ,与R2 2 株消化的图形不一致。结论 湖北省HFRS流行为混合疫区 ;汉城型M片段基因稳定 ,汉滩型M片段基因不稳定 ,且在湖北地区具有一定的地理聚族性。

肾综合征出血热早期实验室诊断

目的:探讨肾综合征出血热(HFRS)患者的早期实验室诊断。方法:分别利用酶联免疫吸附(ELISA)法检测HFRS患者抗体IgM,免疫荧光法(IFA)检测患者抗体IgG,套式RT-PCR法检测患者血清中的病毒RNA,同时对PCR产物M基因部分片段进行序列分析。结果:16例发病1周以内的患者的血清样本中,IgM阳性比例为9/16,IgG阳性比例为9/16,2者均阳性者为7例,IgM或IgG最早出现在发病后第4天。16例患者中RT-PCR阳性表达有11例,其中在发病≤5d的患者样本中,RT-PCR阳性比例达到11/12,基因分型均为SEO型。结论:相对于血清学检测,利用RT-PCR进行HFRS患者的病毒核酸检测更有利于早期诊断及分子流行病学调查。

PCR-ELISA用于HFRS病人早期诊断的研究

目的 建立检测HFRS患者血清标本中HV基因的PCR -ELISA方法。方法 设计并合成互补于HVS基因片段的标记引物 ,对 98例HFRS患者血清进行RT -nestedPCR扩增 ,并用酶免方法分析扩增产物。结果 98例患者不同病日采集的血清标本的RT -nestedPCR平均检出率仅为 6 0 .2 % ,而PCR -ELISA平均检出率为 80 .6 %。结论 PCR

恙螨体内肾综合征出血热病毒基因的套式PCR检测

目的：检测恙螨体内微量肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）基因。方法：选择ＨＦＲＳＶ膜蛋白（ＭＰ）基因的保守区核苷酸序列合成两对引物，采用异硫氰酸胍一步抽提ＲＮＡ，建立了反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测鼠体恙螨及游离恙螨体内ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ的方法，扩增产物经凝胶电泳及点印迹杂交证实具有特异性。结果：ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体恙螨５０只组、１０只组、游离恙螨５０只组，经ＲＴ－ＰＣＲ检测为阳性；ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体恙螨５只组，ＨＦＲＳＶ抗原阴性鼠体恙螨５０只、１０只和５只组，游离螨１０只和５只组均未见明显扩增带。进一步用ＮｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ检测，在ＲＴ－ＰＣＲ未检测出ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ各组中均检测有ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ，最低检出为５只螨组。并用核酸分子杂交技术进一步证实了上述结果。结论：ＮｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ具有高特异、高敏感的特点，可用于检测恙螨体内微量ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ，从分子生物学角度为恙螨作为ＨＦＲＳＶ的传播媒介提供了直接证据。

RT-nested PCR检测肾综合征出血热患者血清病毒核酸

采用异硫氨酸胍-酚-氯仿（AGPC）一步法提取病毒-RNA，并依据肾综合征出血热病毒（HFRSV）核蛋白（NP）编码基因保守区核苷酸序列合成两对巢式引物，建立了逆转录巢式聚合酶链反应（RT－nestedPCR）检测HFRSVRNA方法。应用此法对HFRSV感染的VeroE6细胞培养液及HFRS患者血清中的病毒RNA进行检测。结果显示，感染细胞培养液及35例HFRS患者血清均为阳性，正常的VeroE6细胞及20例正常人血清均为阴性。将HFRSV感染细胞提取的RNA进行10倍系列稀释，可检出10（－7）稀释度的病毒RNA（约0.2pg）。该法灵敏、特异、快速、简便，为从分子水平探讨HFRS的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段。

原位RT-PCR检测革螨体内HFRSV的实验研究

目的 确定肾综合征出血热病毒 (HFRSV)在革螨体内分布和定位 ,进一步证明革螨作为HFRS传播媒介的意义。方法 采用原位RT -PCR分子杂交技术检测鼠肺组织细胞内和革螨体内的HFRSV -RNA。结果 阳性信号呈弥散分布 ,多见于鼠肺吞噬细胞、血管内皮细胞等组织细胞内 ;革螨体内的阳性信号主要分布于卵巢细胞、中肠及支囊上皮细胞中 ,前体组织细胞较少。结论 地高辛素标记的核酸探针原位RT

湖北省不同地区汉坦病毒M片段的分析研究

参考汉坦病毒（ＨＶ）的基因文库软件设计Ｍ片段Ｇ－１区型特异性引物，以ＨＶ ７６／１１８、Ｈ－１１４、Ａ－９及Ｒ－｛２２｝株ＲＮＡ为阳性模板，建立ＨＶ的分型方法──逆转录一半巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ｈｅｍｉｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ），对湖北省不同地区分离的３０株ＨＶ进行分 型。结果显示：（１）建立的ＲＴ－ｈｅｍｉｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ分型方法对ＨＶ两型的代表株７６／１１８（ＨＴＮ）、Ａ－９（ＨＴＮ）、Ｈ－１１４（ＨＴＮ）及Ｒ－｛２２｝（ＳＥＯ）ＲＮＡ进行了特异性扩增，其大小与理论值一致；此 法只能检测ＨＶ ＲＮＡ，不能检测其它病毒ＲＮＡ。（２）分离于湖北省不同地区的３０株ＨＶ的分型结果 为汉滩型２１株、汉城型９株，其中长江以南汉滩型１２株、汉城型２株；长江以北汉滩型９株、 汉城型７株。这表明建立的ＲＴ－ｈｅｍｉｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ用于ＨＶ的检测特异性好；分析湖北省不同 地区分离的３０株ＨＶ，显示湖北省ＨＦＲＳ流行为混合疫区；且在湖北地区具有一定的地理聚集性。

应用逆转录酶链反应对我国流行性出血热病毒分型

针对我国流行性出血热病毒的S片段核蛋白 (NP)编码基因保守核苷酸序列 ,合成了一对引物 ,扩增出编码核蛋白的 5 90bp碱基。扩增的II型产物存在限制性内切酶PstI的酶切位点 ,而I型产物不存在。因此 ,用酶切扩增产物的方法达到病毒分型的目的。试验提取 8份鼠脑传代毒种 ,1份细胞培养物和 2 5份病人血清中的出血热病毒RNA ,同时做 6份正常人血清对照 ,经逆转录PCR酶切分型。试验结果同间接免疫荧光技术 (IFA)分型结果相一致 ,可特异地对我国流行性出血热病毒进行分型。

肾综合征出血热患者外周血单个核细胞中病毒蛋白和病毒核酸动态变化的研究

为进一步研究肾综合征出血热（HFRS）病毒核蛋白（NP）、胰蛋白（MP）及病毒核酸在HFRS患者外周血单个核细胞（PBMC）中的动态变化，揭示HFRSV在患者PBMC中感染、增殖及消亡之规则，应用免疫细胞化学方法测定18例HFRS患者不同病目的95份外周血单个核细胞中的NP和MP抗原。结果表明：第3病日，即可在患者PBMC中检测到Np师和Mp；第3～5病日，病毒结构蛋白表达较强，6～10日明显变弱，第18病目逐渐消失。逆转录-聚合酶键反应（RT－PCR）检测HRFSV－RAN的研究发现，第3病日至14病日均能检测到病毒的存在。RT－PCR技术对临床的早期诊断和流行病学调查提供了一个快速敏感的诊断方法。

遵义地区汉族人群流行性出血热相关等位基因的分布

目的:从基因水平调查遵义地区汉族人群与流行性出血热(EHF)相关的人类白细胞抗原(HLA)-A*31、B*40、B*58、DRB1*16等位基因分布状况。方法:应用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法对遵义汉族200名健康个体进行HLA-A、B、DR位点基因分型,筛选出HLA-A*31、B*40、B*58、DRB1*16阳性标本,进一步做高分辨基因亚型分型,进而对遵义汉族人群的这几组等位基因与其他不同人群的分布情况做比较。结果:遵义地区汉族HLA-A*31、B*58、DRB1*16基因各检出1种亚型,HLA-B*40共检出4种等位基因亚型,其中B*4001、B*4002、B*4006为常见亚型,B*4063为罕见基因亚型。遵义汉族人群所检出的等位基因频率大部分与我国其他地区的相接近,而与日本人比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:本研究获得了遵义汉族人群与EHF相关的HLA等位基因分布特征,为HLA与疾病相关性及本地区群体遗传学等方面的研究提供了重要依据。

山东地区肾综合征出血热患者基因诊断分型研究

采用逆转录聚合酶链反应 ( RT- PCR) ,对山东地区 60例肾综合征出血热 ( HFRS)患者的临床标本进行扩增 ,采用酶切分析鉴定扩增产物的特异性。结果 :60例标本均呈 型或 (和 ) 型阳性 ,扩增片段的大小与理论值一致。表明山东地区流行的 HFRS 型和 型毒株同时存在 ,以 型为主 ;RT-PCR是一项较特异。

套式反转录-聚合酶链反应检测恙螨及鼠肺内肾综合征出血热病毒RNA

选择覆盖肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）膜蛋白（ＭＰ）基因的保守区核苷酸序列合成２对引物，采用异硫氰酸胍一步抽提ＲＮＡ，建立了ＲＴ－ＰＣＲ检测鼠体恙螨及游离恙螨体内ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ的方法，扩增产物经凝胶电泳及斑点印迹杂交证实具有特异性。结果显示，ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体恙螨５０只组、１０只组、游离螨５０只组，ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠肺１０００ｍｇ、５００ｍｇ组经ＲＴ－ＰＣＲ检测为阳性；ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体恙螨５只组，ＨＦＲＳＶ抗原阴性鼠体恙螨５０只和１０只组，游离螨１０只和５只组，鼠肺ＨＦＲＳＶ抗原阳性１００ｍｇ组均未见有明显扩增带。进一步用套式反转录－聚合酶链反应（ＮｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ）检测，在ＲＴ－ＰＣＲ未测出ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ的各组中均检测有ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ。结果表明ＮｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ具有高特异、高敏感的特点，可用于检测恙螨体内微量ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ，为确认恙螨作为ＨＦＲＳＶ的传播媒介提供了分子生物学证据。

汉坦病毒抗原性差异及其基因分型

用抗汉坦病毒单克隆抗体（ＭｃＡｂ）对汉坦病毒Ｂ７８株（来自病人血）和Ｒ１７８株（分离自褐家鼠）进行间接免疫荧光试验，以分析病毒的单克隆抗体反应谱，又用病毒免疫血清进行交叉中和试验，结果表明，两株病毒均具有双型（Ⅰ型／ＨＴＮ型和Ⅱ型／ＳＥＯ型）反应特征，但Ｒ１７８株基本上属于Ⅰ型。用汉坦病毒Ⅰ－Ⅳ型型特异性引物进行ＰＣＲ扩增，Ｂ７８株用Ⅰ型和Ⅱ型引物均得到特异性扩增，而Ｒ１７８株虽经重复扩增均未见特异性扩增片段。初步认为，Ｂ７８株和Ｒ１７８株可能是发生在宿主转换（野鼠→家鼠）过程中介于Ⅰ型和Ⅱ型之间的过渡型变异株，而这类双型病毒在自然界中可能比较常见。这对阐明汉坦病毒的变异规律及广谱抗原性毒株的研制具有一定的理论和实际意义。

聚合酶链反应检测汉坦病毒感染的实验研究

目的 早期诊断汉坦病毒感染。方法 根据国际标准株（７６１１８ ，８０３９） Ｍ 基因Ｇ１ 区设计两对公有引物和一条探针，按异硫酸氰胍—酚一步法提取汉坦病毒ＲＮＡ，采用ＲＴｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ检测病毒细胞培养上清原液及稀释液、１６ 份对照组血清、４０ 份ＨＦＲＳ急性期（１ ～５ 天） 血清标本中的汉坦病毒ＲＡＮ，所有扩增产物采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 或Ｄｏｔ ｂｌｏｔ 证实其特异性。结果 汉坦病毒细胞培养液和４０ 份ＨＦＲＳ急性期血清标本中的３８ 份均可扩增出特异性的片段４５３ｂｐ ，而１０ 份正常人血清和１２ 份非ＨＦＲＳ血清均为阴性，该方法敏感度高于细胞培养。结论 ＲＴｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ 是一种敏感、特异、快速的方法，可用于汉坦病毒感染的早期诊断。

PCR-SSCP法分析汉坦病毒在乳鼠中的基因变异

目的：研究汉坦病毒在感染乳鼠体内有无基因变异．方法：用陈株病毒感染Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞并继之感染３ｄ龄乳鼠，提取病毒ＲＮＡ并反转录成ｃＤＮＡ，以ＰＣＲ分别从感染细胞和乳鼠中克隆出病毒的部分Ｇ２编码区序列，继而用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对之进行单链构象多态性（ＳＳＣＰ）分析．结果：从感染细胞和乳鼠中克隆出的此位置和大小完全相同的ｃＤＮＡ片段单链电泳构像明显不同，从感染乳鼠中克隆的基因片段单链电泳速率明显快于从感染细胞中克隆的相应基因片段．结论：汉坦病毒的基因序列可因寄生宿主的不同而发生变异．

肾综合征出血热患者血清样本中汉坦病毒RNA检测及其临床意义

目的 观察病毒血症在病程各期的变化。方法 根据汉坦病毒血清Ⅰ型 76 - 1 1 8株及血清Ⅱ型 80 -39株M基因G1区设计两对公有引物及一条探针 ,应用RT nestedPCR方法对 5 7例 96份肾综合征出血热(HFRS)患者血清中HV RNA检测 ,所有PCR产物用DOT Blot证实。结果 96份样本中 6 8份阳性 ,阳性率70 .8% ;在病程第 1、2、3周 ,HV RNA检测率分别为 94.7%、47.5 %、2 5 % ,P <0 .0 5 ;重型病人持续 2周HV RNA阳性检测率 1 0 0 % ,而轻、中型分别为 1 2 .5 %及 42 .8% ,P <0 .0 5。结论 在HFRS病程中 ,病毒血症是一个急性过程 ,与发热期相平行 。

FQ-PCR溶解曲线技术初步分析HFRS患者PBMC中T细胞TCRα链CDR3谱系特征

目的采用FQ-PCR溶解曲线技术初步分析肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)患者外周血T细胞TCRα链各可变区基因家族(TRAV)CDR3谱系特征。方法提取4例健康志愿者和15例HFRS患者外周血单个核细胞(PBMC)的总RNA,逆转录成c DNA,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增34条TRAV基因家族CDR3受体库,采用溶解曲线技术分析CDR3谱系特征,并测序分析部分单克隆家族CDR3区基因和氨基酸序列的组成和特征。结果健康志愿者外周血T细胞TCRα链34个TRAV家族CDR3的溶解曲线谱型图呈现CDR3多克隆增生的高斯分布;15例HFRS患者多数TRAV家族CDR3的溶解曲线谱型图为多克隆增生的高斯分布,但出现数量不等的单克隆、寡克隆、极低水平表达的TRAV家族。部分测序结果显示TCRα链优势取用TRAV家族的CDR3区有着不同的基因序列和氨基酸组成。结论HFRS患者外周血中TCRα链各TRAV家族CDR3溶解曲线谱型图出现数量不等,形态不一的单峰、寡峰/偏峰、极低水平的现象,表现出不同的异常频率,TRAV优势取用家族的CDR3区有着不同的基因序列和氨基酸组成,实验结果可为进一步研究HFRS个体特异性T细胞应答提供基础。

汉坦病毒核酸检测试剂参考品的研制

目的 研制汉坦病毒核酸检测试剂参考品并制定其质量评价标准。方法 收集汉坦病毒阳性和阴性临床分离株样本,制备汉坦病毒RNA噬菌体模拟样本,使用宏基因组测序方法和实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法进行核酸序列鉴定。选择合适样本组成参考品并使用不同试剂对参考品进行协作标定。根据标定结果确定汉坦病毒核酸检测试剂参考品的质量标准,并评估其稳定性。结果 汉坦病毒核酸检测试剂参考品由20份样本组成,包括阳性参考品5份(PC01~PC05)、阴性参考品11份(NC01~NC11)、精密性参考品2份(R01、R02)以及检出限参考品2份(S01、S05)。其中,检出限参考品1:10梯度稀释后,要求S02、S03为汉坦病毒汉滩型阳性,S06、S07为汉坦病毒汉城型阳性,其余样本不做要求。稳定性评价结果表明,汉坦病毒核酸检测试剂参考品经25℃室温放置24 h或反复冻融3次均不影响参考品性能。结论 本研究研制了汉坦病毒核酸检测试剂参考品,并制定了其质量标准,可应用于相关定性检测试剂的质量评价。

应用聚合酶链反应技术对汉坦病毒检测分型研究

为探讨肾综合征出血热(HFRS)的病毒检测和分型及其治疗,分别应用RT-PCR及ELISA检测95例HFRS病人血清中的HFRSV基因及SIL-2R的含量。结果显示:HFRSV基因检出率为35.79％(34/95),越早期阳性率越高,以汉坦型为主,并与血凝抑制试验检测结果相符。SIL-2R的含量在发病过程中皆明显升高,其程度随病期进展而改变,与病型的轻重呈正比。