JA1对体外培养的Hep细胞和小鼠皮下移植性Hep细胞凋亡的影响

采用噻唑蓝(MTT)还原法、流式细胞术、光镜及透射电子显微镜技术等检测了梯度浓度的JA1(沙冬青提取物)对体外培养的小鼠肝癌细胞株Hep增殖的影响及诱导Hep细胞凋亡的作用;并检测了JA1对小鼠皮下移植性Hep细胞的生长抑制及诱导凋亡作用。结果显示,JA1可显著抑制小鼠Hep细胞的增殖,且这种抑制有浓度和时间依赖性。流式细胞仪分析显示,JA1处理后的Hep检测样本中有明显的DNA低含量颗粒("亚G1期"峰),细胞周期各时相分布发生了改变,细胞在G1期被阻滞。同时,JA1对小鼠皮下移植性Hep细胞也有明显的抑制作用。JA1灌胃试验组瘤组织细胞DNA直方图有明显的凋亡峰,细胞在G1期也被阻滞,光镜和电镜下可见大量凋亡肿瘤细胞。

2-(4-甲氧基-苯巯基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮诱导Hep3B人肝癌细胞凋亡的机制

近年来,紫草萘醌类衍生物因其临床应用受到副作用的限制。为寻找副作用小疗效高的新型抗肿瘤药物,合成了2-(4-甲氧基-苯巯基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮,并对其化学结构进行了鉴定。同时研究了2-(4-甲氧基-苯巯基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮对人肝癌细胞活力、凋亡的影响及其潜在机制。研究结果表明,通过MTT检测其细胞活力,发现2-(4-甲氧基-苯巯基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮显著降低了人肝癌细胞系的细胞活力。蛋白免疫印迹结果表明,该化合物可通过上调Cle-caspase3、Bad和Bax凋亡相关蛋白表达水平来诱导肝癌细胞Hep3B凋亡。为进一步检测2-(4-甲氧基-苯巯基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮诱导Hep3B细胞发生凋亡的原因,使用荧光探针JC-1检测了2-(4-甲氧基-苯巯基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮处理后Hep3B细胞内线粒体膜电位的变化。结果发现,与对照组相比,药物处理组线粒体膜电位显著下降,绿色荧光增强,红色荧光减弱,说明2-(4-甲氧基-苯巯基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮能通过线粒体损伤来诱导Hep3B细胞凋亡。由于2-(4-甲氧基-苯巯基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮显著诱导Hep3B细胞凋亡。因此,2-(4-甲氧基-苯巯基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮具有良好的抗肿瘤活性。

葡萄籽提取物原花青素通过LncRNA NBR2/miR-650调节EMT抑制肝癌细胞Hep3B增殖、迁移和侵袭的分子机制

目的探讨葡萄籽提取物原花青素是否通过长链非编码RNA(LncRNA)NBR2/微小RNA(miR)-650并调节上皮间充质转化(EMT)来影响肝癌细胞Hep3B的增殖、迁移和侵袭。方法将肝癌细胞Hep3B分为NC组(未处理),低、中、高剂量组(给予25、50、100μg/ml葡萄籽提取物原花青素),si-NC组,si-LncRNA NBR2组,si-NC+高剂量组、si-LncRNA NBR2+高剂量组,anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高剂量组,anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高剂量组。采用Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、EMT过程E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)蛋白表达,细胞计数试剂盒(CCK)-8、Transwell法和定量RT-PCR(qRT-PCR)分析细胞增殖、迁移、侵袭与LncRNA NBR2、miR-650的表达。双荧光素酶活性检测LncRNA NBR2和miR-650的靶向结合。结果低、中、高剂量组葡萄籽提取物原花青素作用的肝癌细胞Hep3B CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达量、增殖能力、迁移数量、侵袭数量、miR-650表达量均低于NC组,LncRNA NBR2表达量高于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量组葡萄籽提取物原花青素作用的肝癌细胞Hep3B细胞中E-Cadherin蛋白表达量高于NC组,N-Cadherin、Vimentin蛋白表达量低于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。si-LncRNA NBR2组的肝癌细胞Hep3B细胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达量、增殖能力、迁移和侵袭数量均比si-NC组高,差异有统计学意义(P<0.05)。si-LncRNA NBR2+高剂量组肝癌细胞Hep3B细胞中CyclinD1、MMP2、MMP9、N-Cadherin、Vimentin蛋白表达量、增殖能力、迁移和侵袭数量均高于si-NC+高剂量组,E-Cadherin蛋白表达量低于si-NC+高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。LncRNA NBR2靶向调控miR-650的表达。anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高剂量组肝癌细胞Hep3B CyclinD1、MMP2、MMP9、N-Cadherin、Vimentin蛋白、LncRNA NBR2表达量及增殖能力、迁移和侵袭数量均低于anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高剂量组,E-Cadherin蛋白表达量高于anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论葡萄籽提取物原花青素通过上调LncRNANBR2靶向下调miR-650并调节EMT,来抑制肝癌细胞Hep3B的增殖、迁移和侵袭。

猫棒束孢对IR-Hep G2细胞氧化应激的改善作用及机制

目的探讨猫棒束孢(IF)对胰岛素抵抗Hep G2(IR-HepG2)细胞氧化应激的保护作用及其机制。方法MTT法测定不同浓度IF和胰岛素对Hep G2细胞增殖的影响,用含10-8 mol·L^(-1)胰岛素的高糖DMEM培养基诱导Hep G2细胞48 h,建立Hep G2细胞胰岛素抵抗模型。采用试剂盒测定葡萄糖消耗量、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、胰岛素受体底物1(IRS-1)、磷脂酰肌醇-3-羟基酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)的含量。结果在IF浓度为5μg·mL^(-1)和10μg·mL^(-1)对细胞生长无显著促进作用,故浓度选用于5μg·mL^(-1)和10μg·mL^(-1);胰岛素处理48 h后只有10-8 mol·L^(-1)剂量组对照细胞生长无显著抑制作用,故选用胰岛素浓度为10-8 mol·L^(-1),培养48 h建立胰岛素抵抗模型。与正常组比较,模型组IR-Hep G2细胞葡萄糖消耗量显著下降(P<0.01);与模型组比较,各浓度猫棒束孢干预后的IR-Hep G2细胞的葡萄糖消耗量显著上升(P<0.01)。与正常组比较,模型组Hep G2细胞的SOD含量显著下降(P<0.01),MDA含量显著上升(P<0.01),IRS-1、PI3K、Akt的含量显著下降(P<0.05)。经IF处理后SOD含量显著提高(P<0.01),MDA含量显著降低(P<0.01),IRS-1、PI3K、Akt的含量显著升高(P<0.01、P<0.05、P<0.01)。结论IF能够改善胰岛素抵抗Hep G2细胞模型的糖代谢和氧化应激水平,并通过调控IRS-1/PI3K/Akt信号通路起到改善胰岛素抵抗的作用。

布比卡因对肝癌细胞Hep3B增殖、迁移及侵袭能力的影响

目的:探讨布比卡因对肝癌细胞Hep3B增殖、迁移及侵袭能力的影响及其可能作用机制。方法:体外培养人肝癌细胞Hep3B,分为空白对照组、100μmol/L布比卡因组、200μmol/L布比卡因组、400μmol/L布比卡因组,miR-阴性对照(NC)组、miR-143-3p组,抗miR-NC+400μmol/L布比卡因组、抗miR-143-3p+400μmol/L布比卡因组;分别采用MTT法、流式细胞仪、Transwell实验检测细胞增殖能力、细胞周期、迁移及侵袭能力;qRT-PCR法检测miR-143-3p表达情况;Western blot法检测CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达情况。结果:与空白对照组比较,100、200、400μmol/L布比卡因组细胞增殖能力和CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平逐渐降低,S期细胞比例逐渐降低,迁移及侵袭细胞数逐渐减少,miR-143-3p表达水平和G1期细胞比例逐渐升高(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-143-3p组细胞增殖能力和CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平降低,迁移及侵袭细胞数减少,S期细胞比例降低,G1期细胞比例逐渐升高(P<0.05)。与抗miR-NC+400μmol/L布比卡因组比较,抗miR-143-3p+400μmol/L布比卡因组细胞增殖能力和CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平升高,迁移及侵袭细胞数增多,S期细胞比例升高,G1期细胞比例降低(P<0.05)。结论:布比卡因可通过调控miR-143-3p抑制肝癌细胞Hep3B增殖、迁移、侵袭,诱导细胞周期阻滞。

miR-4465通过靶向下调HMGA1的表达抑制肝细胞癌Hep3B细胞的恶性生物学行为

目的:探讨miR-4465靶向高迁移率族蛋白A1(HMGA1)对肝细胞癌Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:收集2020年5月至2021年9月在皖南医学院第一附属医院确诊为肝细胞癌患者的16对癌组织和癌旁组织样本,采用qPCR分析miR-4465在肝细胞癌组织和Hep3B、Huh7细胞中的表达情况,双荧光素酶报告基因实验验证miR-4465与HMGA1的调控关系。按转染物的不同将Hep3B细胞分为mimics-NC组、miR-4465-mimics组、inhibitor-NC组、miR-4465 inhibitor组、si-NC组、si-HMGA1组;另外分组转染mimics-NC+pcDNA-NC、miR-4465 mimics+pcDNA-NC和miR-4465 mimics+pcDNAHMGA1进行回复实验。采用qPCR和WB法检测各组细胞中HMGA1 mRNA和蛋白水平的变化,CCK-8法检测各组细胞增殖能力的变化,划痕实验检测各组细胞迁移能力的变化,Transwell实验检测各组细胞侵袭能力的变化。结果:miR-4465在肝细胞癌组织和细胞中的表达水平显著低于癌旁组织和正常肝细胞(P<0.05或P<0.001)。转染48 h后,过表达miR-4465的Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭能力均显著下降(P<0.05、P<0.01或P<0.001);敲低miR-4465后细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显升高(P<0.05、P<0.01或P<0.001)。双荧光素酶报告实验验证了HMGA1-3’UTR与miR-4465的靶向结合关系,miR-4465可以靶向下调HMGA1mRNA和蛋白质的表达(均P<0.01)。过表达HMGA1能部分逆转过表达miR-4465对细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用及HMGA1表达的抑制作用(均P<0.05)。结论:miR-4465通过靶向下调HMGA1在肝细胞癌Hep3B细胞中的表达,从而抑制Hep3B细胞的恶性生物学行为。

miR-3612靶向SEMA4C调控肝细胞癌细胞的恶性生物学行为

目的:探讨miR-3612靶向信号素(SEMA)4C对肝细胞癌细胞增殖与侵袭能力的影响。方法:收集2020年5月至2021年9月间在皖南医学院第一附属医院弋矶山医院手术切除的肝细胞肝癌的40对癌组织和相应癌旁组织,常规培养肝细胞癌Hep3B和Huh7细胞,将其分为对照组、miR-3612 mimics-NC组、miR-3612 mimics组、miR-3612 inhibitor-NC组、miR-3612 inhibitor组、si-NC组、si-SEMA4C组、mimics-NC+pcDNA-NC组、miR-3612 mimics+pcDNA-NC组和miR-3612 mimics+pcDNA-SEMA4C组,用转染试剂将相应的核酸和质粒转染各组细胞。qPCR法检测miR-3612和SEMA4C mRNA在肝细胞癌组织和Hep3B和Huh7细胞中的表达,双荧光素酶报告基因实验和免疫共沉淀(RIP)实验验证miR-3612与SEMA4C的结合及调控关系,qPCR法和WB法检测转染后各组Hep3B和Huh7细胞中miR-3612、SEMA4C mRNA和蛋白的表达,CCK-8法、细胞划痕实验和Transwell小室实验分别检测各组Hep3B和Huh7细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果:miR-3612在肝细胞癌组织和Hep3B和Huh7细胞中呈低表达(P<0.001),而SEMA4C则呈高表达(P<0.001),过表达miR-3612可抑制Hep3B和Huh7细胞的增殖、迁移、侵袭和vimentin、SEMA4C蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白的表达(P<0.05或P<0.01或P<0.001),敲低miR-3612则促进Hep3B和Huh7细胞的增殖、迁移、侵袭和SEMA4C蛋白的表达(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验和RIP实验证实miR-3612与SEMA4C可直接结合(P<0.001),miR-3612与SEMA4C的表达呈负相关也间接证明了这一点(P<0.001)。敲减SEMA4C能明显抑制Hep3B、Huh7细胞的增殖、侵袭和迁移能力(P<0.05或P<0.01或P<0.001),过表达SEMA4C可逆转过表达miR-3612对Hep3B和Huh7细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的抑制作用(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。结论:miR-3612通过调控SEMA4C表达影响Hep3B和Huh7细胞的恶性生物学行为,miR-3612有望成为临床肝细胞癌治疗的潜在靶点。

miR-1264对喉癌Hep2细胞增殖和迁移的影响

目的 miR-1264在喉癌中表达下调。文中旨在研究miR-1264对喉癌Hep2细胞生物学功能的影响及是否参与下调LCRG1基因的表达。方法 Real-time quantitative PCR检测miR-1264在人喉癌组织中的表达情况;将转染mimic/inhibitor NC Hep2细胞设为对照组,将未转染Hep2细胞设为空白组,将转染miR-1264 mimic/inhibitor设为实验组。利用MTT、Transwell分别观察miR-1264对Hep2细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;luciferase实验验证miR-1264和LCRG1 3'UTR的结合;RT-PCR、Western blot分别检测miR-1264、LCRG1蛋白表达。结果与对照组和空白组相比,Hep2细胞瞬转miR-1264mimic后,活细胞数量明显增加,增殖能力显著增强(P<0.05);而瞬转miR-1264 inhibitor后,活细胞数量明显降低,增殖能力减弱(P<0.05)。与对照组[(80.80±1.07)个]及空白组[(73.60±1.44)个]迁移细胞数量相比,实验组[(97.00±1.41)个]明显增加(P<0.05),迁移能力亦显著增强(P<0.05);与对照组[(80.00±1.11)个]及空白组[(73.60±1.44)个]迁移细胞数量相比,miR-1264 inhibitor组[(71.40±1.21)个]明显降低(P<0.05),迁移能力亦减弱(P<0.05)。与对照组[(43.00±1.41)个]和空白组[(50.60±1.03)个]侵袭细胞数量相比,实验组[(57.00±1.00)个]明显增加(P<0.05),侵袭能力亦显著增强(P<0.05);与对照组[(61.20±1.50)个]和空白组[(50.60±1.03)个]侵袭细胞数量相比,实验组[(27.60±0.93)个]明显降低,侵袭能力受到显著抑制(P<0.05),利用RT-PCR验证瞬转成功后,进一步应用Western blot实验检测LCRG1蛋白表达结果,显示:实验组LCRG1蛋白表达较NC对照组和空白组均无明显差异(P>0.05)。结论 miR-1264在喉癌组织中高表达,miR-1264可能不参与LCRG1蛋白的表达下调,但能增强Hep2细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

壁虎醇提物诱导人喉癌细胞Hep2凋亡的实验研究

本文研究了壁虎乙醇提取物(GEE)诱导Hep2细胞凋亡的作用。采用噻唑蓝比色法(MTT)检测了GEE对Hep2细胞增殖的抑制作用,发现GEE可呈剂量-时间依赖性的抑制Hep2细胞的增殖,GEE作用24、48、72 h后其IC50值分别为336.858、237.949、188.991μg/mL。Hoechst 33258荧光染色后在显微镜下可观察到Hep2细胞发生了典型凋亡的形态学变化;利用Western blot法证实在Hep2细胞中GEE可诱导caspase-3和抑制VEGF蛋白的表达。这些结果表明GEE可能是通过上调Caspase-3和下调VEGF蛋白的表达诱导Hep2细胞的凋亡。

齐墩果酸对肝癌细胞Hep3B增殖和凋亡的作用研究

目的研究齐墩果酸对人肝癌细胞株Hep3B增殖和凋亡的影响及其与细胞内钙离子浓度{[Ca2+]i}关系。方法将浓度分别为40、80、100μg/ml齐墩果酸作用于肝癌Hep3B细胞24 h以后,DAPI染色,荧光显微镜观察对照组和处理组细胞形态变化;以11组不同浓度齐墩果酸(5～400μg/ml)作用Hep3B细胞24 h后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测Hep3B细胞增殖情况;分别以不同浓度齐墩果酸(80、100、150μg/ml)作用Hep3B细胞24 h后,流式细胞仪检测细胞周期变化、细胞凋亡率、细胞内钙离子浓度;对钙离子荧光强度与细胞凋亡率进行相关性分析。结果各处理组Hep3B细胞出现凋亡;不同浓度齐墩果酸能够抑制肝癌细胞Hep3B增殖,且在5～100μg/ml范围内呈剂量依赖性,药物作用细胞24、48 h的IC50分别为86.04、93.29μg/ml;各处理组细胞周期在G2/M期产生阻滞、[Ca2+]i较对照组显著增加(P<0.05),细胞凋亡率和[Ca2+]i增加与药物浓度呈依赖关系;钙离子荧光强度与细胞凋亡率之间存在线形相关性(P<0.05)。结论齐墩果酸能够抑制肝癌Hep3B细胞株增殖,可能通过上调[Ca2+]i诱导其凋亡。

舒芬太尼抑制肝癌Hep3B细胞活性及促进凋亡作用

目的探讨舒芬太尼对肝癌Hep3B细胞活性的影响及相关机制。方法以Hep3B肝癌细胞为研究对象,经不同浓度(0.01、0.1、1、5、10、15μmol/L)舒芬太尼处理后,MTT法观察细胞活性的改变,流式细胞仪及AnnexinV/PI双标记染色检测Hep3B细胞周期及凋亡的变化,Western blot检测survivin及caspase-3蛋白的表达。结果随着舒芬太尼浓度的增加,肝癌细胞活性降低,细胞周期停滞在G0/G1期,细胞凋亡增多,survivin蛋白表达量降低,caspase-3蛋白表达量升高。结论舒芬太尼能通过改变肝癌细胞的细胞周期,促进细胞凋亡,改变survivin和caspase-3蛋白的表达,抑制Hep3B细胞的活性。

汉防己碱对肝癌Hep3b细胞生长的双向作用

目的考察汉防己碱(tetrandrine,Tet)对肝癌Hep3b和Hep3b/5-Fu细胞生长的影响。方法采用体外细胞培养,结合流式细胞术、MTT和Western blot方法研究Tet(0.33～1.0μg/ml)对肝癌Hep3b及Hep3b/5-Fu细胞生长的作用特点。结果 Tet在0.33～1.0μg/ml时呈浓度依赖性降低Hep3b细胞存活率;0.5和1.0μg/ml显著提高5-Fu对Hep3b细胞的IC50,但降低5-Fu对Hep3b/5-Fu细胞的IC50;0.33μg/ml的Tet明显增加cDDP对Hep3b/5-Fu细胞的IC50,而0.5和1.0μg/ml显著降低cDDP对Hep3b/5-Fu细胞的IC50(P<0.01)。1.0μg/ml的Tet作用48 h后使Hep3b细胞中的P-gp和MRP1表达明显上调(P<0.05)。Tet单用对Hep3b细胞生长有一定抑制作用,高浓度Tet逆转Hep3b/5-Fu细胞对5-Fu耐药和增强cDDP对Hep3b/5-Fu细胞生长的抑制作用,但低浓度分别促进Hep3b细胞和Hep3b/5-FU细胞对5-Fu和cDDP耐药。结论 Tet对Hep3b和Hep3b/5-Fu细胞生长呈浓度相关的双向作用,其促进耐药细胞发展的机制至少与提升P-gp和MRP1表达有关。

川芎嗪含药血清对人肝癌细胞HepG_2增殖的抑制作用

目的观察川芎嗪(TMP)含药血清对人肝癌细胞HepG2增殖的影响。方法选用SD雄性大鼠30只,随机分成3组,分别ipTMP143.0、71.5mg/kg、生理盐水0.8mL,制备TMP大、小剂量组及生理盐水组含药血清,采用RP-HPLC法测定含药血清中TMP的质量浓度。将各组含药血清作用于人肝癌细胞HepG248h,MTT法测定不同质量浓度TMP含药血清对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用。结果TMP大剂量组血清(20%、10%、5%),TMP小剂量组血清(20%、10%)对人肝癌细胞HepG2增殖较生理盐水组有显著抑制作用(P<0.05),最高抑制率可达46.1%。结论TMP含药血清对人肝癌细胞HepG2增殖有一定的抑制作用。

内皮素系统在喉癌细胞HEP2的表达

目的内皮素(endothelin,ET)系统在多种恶性肿瘤中均有表达且对恶性肿瘤的演进具有重要调控作用,文中对喉癌细胞HEP2是否存在ET系统进行探讨。方法应用RT-PCR和免疫组化方法分别检测HEP2细胞ET系统的基因和蛋白表达,ELISA法对HEP2细胞ET1分泌情况进行检测。结果HEP2细胞存在ET系统基因及蛋白表达,同时能主动分泌ET1。结论人喉癌细胞存在ET系统的表达,ET1可能是促进喉癌病理发展的重要生物因子。

常氧条件下姜黄素对肝癌Hep1细胞缺氧诱导因子-1α表达的影响

目的为肝癌的治疗提供新思路。方法将对数生长期肝癌Hep1细胞随机分为6组,空白对照组仅加入培养液,实验对照组加入等量溶媒二甲基亚砜(DMSO),姜黄素1～4组分别加入姜黄素5、10、15、20μmol/L。各组均置于常氧环境中培养24 h。RT-PCR法检测HIF-1αmRNA表达,Western blot法检测HIF-1α蛋白表达。结果姜黄素2～4组HIF-1αmRNA表达均明显高于空白对照组(P均<0.05)。姜黄素1～4组HIF-1α蛋白表达均明显高于空白对照组(P均<0.01)。结论常氧条件下,姜黄素呈浓度依赖性方式上调肝癌Hep1细胞HIF-1α的表达。

丙型肝炎病毒NS5B在Hep3B细胞的表达及活性分析

目的丙型肝炎病毒NS5B基因转染人肝癌细胞系Hep3B细胞,检测NS5B的表达与细胞内RNA聚合酶活性。方法使用脂质体把包含全长丙型肝炎病毒NS5B基因的重组载体pcDNA-5B转染到Hep3B细胞。RT-PCR和Wes-tern blot鉴定NS5B基因的表达,荧光素酶检测NS5B的细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结果RT-PCR和Westernblot发现转染NS5B基因的Hep3B细胞产生NS5B mRNA和NS5B蛋白,荧光素酶分析表明Hep3B细胞表达的NS5B蛋白具有细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结论人肝癌细胞系Hep3B细胞可以成功表达NS5B基因,且表达的NS5B蛋白具备细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。

四环素调控的真核表达体系Hep3B Tet-On细胞株的建立

目的 建立可受四环素诱导调控的高表达外源基因的真核表达体系Hep3BTet On细胞株 ,用于基因功能的研究。方法 将pTet On质粒用脂质体介导法转染Hep3B细胞 ,经G4 18筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化。单克隆分别扩增后 ,瞬时转染pTRE luc(编码荧光素酶蛋白 )质粒 ,Dox诱导表达后 ,检测荧光素酶活性 ,逐一筛选四环素调控高表达外源基因的Hep3BTet On细胞株。结果 成功构建了一株受Dox调控的高表达低背景的Hep3BTet On细胞株。结论 Hep3BTet On细胞株可用于外源基因的真核调控高表达 ,为研究真核基因功能提供了一种有力的实验手段。

大黄素在体外诱导人肝癌Hep3b细胞凋亡的作用及机制

目的了解大黄素在体外诱导人肝癌Hep3b细胞凋亡的作用及机制。方法采用MTT法测定不同浓度大黄素对人肝癌Hep3b细胞的抑制作用,不加大黄素作为对照组;采用流式细胞仪检测大黄素作用后的Hep3b细胞的增殖周期,计算细胞增殖指数(PI);Western印迹法检测Hep3b细胞凋亡相关蛋白AKT、Bcl-2、p-AKT和酶切caspase-3的相对表达量。结果 1、5、25、125μmol/L大黄素作用24 h后的OD值均低于对照组(t=1.694、6.129、13.400、34.739,P均<0.05);随着大黄素浓度的升高,它对Hep3b细胞的抑制率呈上升趋势;作用24 h时,大黄素对Hep3b细胞的半抑制浓度(IC50)为21.08μmol/L。25、125μmol/L大黄素作用24、36 h后,Hep3b细胞的G_0/G_1期比例增高(P<0.05),S期比例、PI降低(P<0.05),因而表现出浓度、时间依赖性。大黄素作用时间增加后,抑制细胞凋亡的Bcl-2(24 h:t=2.610;36 h:t=5.713)、p-AKT蛋白(12 h:t=2.075,24 h:t=5.157;36 h:t=12.926)的表达量呈下降趋势(P均<0.05),促进细胞凋亡的酶切caspase-3蛋白的表达量呈上升趋势(6、12、24、36 h:t=2.487、3.327、5.276、8.137,P均<0.05)。结论大黄素在体外通过诱导细胞凋亡而抑制人肝癌Hep3b细胞的增殖,大黄素是通过AKT信号途径诱导Hep3b细胞凋亡。

人肝癌顺铂耐药细胞系SK-Hep1/CDDP的建立

背景与目的:多药耐药是肿瘤治疗的主要障碍,本研究旨在建立人肝癌多药耐药细胞株SK-Hep1/CDDP,并对其生物学特性及发生多药耐药的可能机制进行初步评价。方法:采用大剂量冲击,间歇诱导法获得人肝癌顺铂(Cisplatin,CDDP)多药耐药系SK-Hep1/CDDP;CCK-8法检测药物敏感性,计算半数抑制浓度(IC50)和耐药指数(RI);Western blot检测多药耐药基因(MDR1,ABCB1)、多药耐药相关蛋白1(MRP-1,ABCC1)、多药耐药相关蛋白2(MRP-2,ABCC2)、Bax蛋白的表达,以及加入MDR1抑制剂CsA对肝癌细胞MDR1蛋白的表达影响;流式细胞仪(FCM)检测细胞周期及凋亡率。结果:历时6个月建成SK-Hep1/CDDP细胞株,其对CDDP的耐药指数为13.76,并对盐酸阿霉素(doxorubicin,DOX)、氟尿嘧啶(5-Fluororacil,5-FU)等多种抗肿瘤药物交叉耐药;Westernblot发现SK-Hep1/CDDP与亲本细胞相比MDR1、MRP-1、MRP-2的表达明显升高(P<0.01),Bax蛋白表达明显降低(P<0.01),加入小剂量环孢素A对肝癌细胞MDR1蛋白的表达无影响(P>0.05);细胞周期分析发现相对于亲本SK-Hep1细胞[G1期为(59.83±3.28)%,S期为(27.91±2.16)%,G2/M期为(12.14±3.36)%],SK-Hep1/CDDP耐药细胞[G1期为(37.50±5.05)%,S期为(42.20±2.65)%,G2/M期(20.67±5.69)%]的G2/M,S期比例增加,G1期比例减少,两组相比差异均有统计学意义(P<0.01);流式细胞仪分析表明CDDP对耐药细胞SK-Hep1/CDDP的凋亡率明显减少,加入MDR1抑制剂干预后可明显增加CDDP对SK-Hep1/CDDP细胞的凋亡率。结论:成功建立MDR细胞株SK-Hep1/CDDP,其耐药机制可能与MDR1、MRP-1、MRP-2蛋白的表达增加,Bax蛋白表达降低及降低化疗药物诱导肿瘤细胞的凋亡作用相关。

单次、分次照射与^(125)I粒子低剂量率照射对人喉鳞癌Hep2细胞的抑制作用

目的探讨125I粒子持续低剂量率照射与分次照射、单次照射对人喉鳞癌细胞Hep2的抑制作用及其作用机制。方法实验分为无照射对照组(Ctrl组)、单次照射组(SDR组)、分次照射组(FDR组)和125I粒子持续低剂量率照射组(125I-CLDR组)四组。采用细胞克隆形成实验法检测Hep2细胞在不同照射条件下细胞克隆的形成能力;用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期阻滞情况;用蛋白印迹法检测不同照射条件后Hep2细胞总γ-H2AX、Cyclin B1、Caspase3蛋白表达的变化。结果经2 Gy、4 Gy、6 Gy的剂量照射,125I-CLDR组Hep2细胞克隆形成率均低于SDR组和FDR组。经4 Gy的剂量照射后,125I-CLDR组Hep2细胞出现G2/M期阻滞,且阻滞效应较SDR组及FDR组的细胞强;125I-CLDR组Hep2细胞的凋亡比例明显高于SDR组及FDR组;三个照射组γ-H2AX、Cyclin B1、Caspase3、NF-κB、P21和Cdk1的表达水平上调,125I-CLDR组p-Cdc25c蛋白表达水平低于SDR组和FDR组。结论在本实验条件下,125I粒子持续低剂量率照射较单次照射、分次照射能够诱发更多Hep2细胞出现DNA损伤、引起持续的G2/M期阻滞、诱导细胞凋亡并抑制细胞的再增殖。