Nrf2过表达与敲减Hep1-6稳转细胞株的建立

核因子NF-E2相关因子2(Nrf2)是治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)的一个重要靶点分子。为了从体外研究小分子通过靶向Nrf2改善NAFLD的分子机制,首先PCR克隆鼠源Nrf2基因至p Lenti6/V5-D-TOPO空载体得到重组载体p Lenti6/V5-Nrf2,通过测序、酶切鉴定正确后,扩繁质粒,制备慢病毒并将其感染Hep1-6肝癌细胞,用稻瘟醇胚素筛选、鉴定获得稳定表达Nrf2的细胞株。同时,用Nrf2干扰质粒构建慢病毒感染Hep1-6肝癌细胞,通过嘌呤霉素筛选、鉴定Nrf2敲减的细胞株。Q-PCR检测结果显示,过表达稳转株(p Lenti6/V5-Nrf2)中Nrf2基因的表达量为对照组(p Lenti6/V5-Lac Z)的4倍,敲减稳转株中Nrf2基因的表达量大幅度降低。Western blotting显示过表达稳转株的Nrf2表达量明显高于对照组,敲减稳转株的Nrf2表达量明显低于对照稳转株,此结果与Q-PCR结果一致。所克隆的Nrf2基因和敲减基因在Hep1-6小鼠肝癌细胞中得到了正确转录和翻译,稳转细胞株构建成功。

金线莲多糖对Hep1-6细胞活性的影响

通过采用MTS法、流式细胞术法以及构建RAW264.7/Hep1-6细胞共培养模型检测经不同浓度(0、125、250、500、1 000、2 000μg/mL)金线莲多糖(Anoectochilus roxburghii Polysaccharides, APS)处理的RAW264.7细胞和Hep1-6细胞的增殖及周期情况,研究APS对Hep1-6细胞生长的影响.直接使用APS处理Hep1-6细胞,发现不同浓度APS对Hep1-6细胞增殖无抑制作用,且对其周期无影响.由共培养模型可知,不同浓度APS先作用于RAW264.7细胞24 h后,将RAW264.7细胞及其培养液与Hep1-6细胞共培养24 h后,0、125、500μg/mL试验组与不加药无RAW264.7空白对照组相比,Hep1-6细胞受到一定抑制作用,细胞毒性为1级. 125、500μg/mL试验组与不加药含RAW264.7对照组相比,Hep1-6细胞具有显著抑制(P <0.01),但2 000μg/mL试验组中Hep1-6细胞生长率高于对照组. APS直接作用于Hep1-6对其活性无影响,而RAW264.7与Hepl-6共培养后,RAW264.7可以抑制Hepl-6的生长,加APS处理RAW264.7后再与Hepl-6共培养,一定浓度范围内可以进一步抑制Hepl-6的生长,但过高浓度的APS反而对共培养的Hepl-6生长有一定促进作用.

从Cyclin E1-CDK2-CKIs通路探讨芪灵扶正清解方抑制肝癌细胞株Hep1-6增殖的作用机制

目的从周期蛋白Cyclin E1-细胞周期依赖性蛋白激酶2(CDK2)-CDKs抑制因子CKIs(Cyclin E1-CDK2-CKIs)信号通路角度探讨芪灵扶正清解方(QL)调控小鼠肝癌Hep1-6细胞株增殖的机制.方法体外培养Hep1-6细胞,分别给予不同剂量的QL醇提物(0、31.25、62.5、125、250、500、1000μg/mL)干预Hep1-6细胞株24h、48h和72h.MTT法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞周期各个时相的比例;Western blot检测CDK2、周期蛋白Cyclin E1、视网膜母细胞瘤Rb、磷酸化Rb(p-Rb)以及CDKs抑制因子(CKIs)p57^(KIP2)和p27^(KIP1)的蛋白水平.结果QL醇提物能显著抑制Hep1-6细胞的生长活力,呈剂量依赖性;Hep1-6细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期的DNA合成被抑制;QL醇提物下调了CDK2、Cyclin E1、p-Rb的蛋白水平,上调了p57^(KIP2)和p27^(KIP1)的蛋白水平.结论QL方通过抑制CDK2与Cyclin E1的结合,同时正向调控CKIs抑制Cyclin E1-CDK2复合物的激酶活性,从两方面抑制下游Rb的磷酸化水平,进而有效抑制肝癌Hep1-6细胞的增殖.