HepG2细胞胰岛素抵抗模型建立影响因素研究

目的建立体外肝癌(HepG2)细胞胰岛素抵抗(IR)模型,研究血清添加、诱导剂浓度和培养时间对模型建立的影响。方法采用不同浓度胰岛素对肝癌HepG2细胞进行不同时间的诱导,建立肝细胞IR模型;以葡萄糖氧化酶法研究不同诱导浓度、培养时间及血清添加对胰岛素抵抗模型细胞葡萄糖消耗量(ΔGC)的影响。采用噻唑蓝(MTT)法评价细胞活性,并计算葡萄糖比消耗率(ΔGC/R),得到最佳建模条件。结果适当提高胰岛素诱导浓度可缩短诱导时间,或可通过延长诱导时间来降低诱导浓度。胰岛素能促进HepG2细胞增殖,且在含血清培养基中增殖较迅速。诱导后的细胞在含血清培养基中培养24 h即能得到理想的胰岛素抵抗模型。结论可通过胰岛素诱导培养法建立稳定的IR模型,在含5×10^(-8) mol/L胰岛素的培养基中诱导48 h,再换含血清培养基继续培养24 h,易形成明显的胰岛素抵抗模型。此HepG2细胞模型在较长时间内(72 h)均可维持胰岛素抵抗特性。

粗毛纤孔菌三萜成分分析及其对HepG 2细胞模型的脂质调节作用

为探索粗毛纤孔菌中的总三萜活性成分及其体外降脂能力,采用超高液相色谱-飞行时间质谱联用技术(UPLC-TOF-MS/MS)对粗毛纤孔菌中的总三萜进行定性分析,并通过油酸诱导建立HepG_(2)细胞高脂模型,以HepG_(2)细胞高脂模型的存活率、脂质积累量和血脂四项为指标,考察粗毛纤孔菌纯化后总三萜的体外降脂能力。根据UPLC-TOF-MS/MS得到的洗脱顺序、保留时间、分子量、质谱信息,结合文献,共鉴定出粗毛纤孔菌中三萜成分8种。体外实验表明,400μmol/L油酸孵育HepG_(2)细胞24 h时,HepG_(2)细胞内的脂质积累量最高。相较于其他浓度组,总三萜质量浓度为250μg/mL时,高脂HepG_(2)细胞内的脂质含量下降最为显著,总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇的清除率分别达到41.86%、44.44%、44.02%,高密度脂蛋白胆固醇的增长率达到57.33%。研究结果证实了粗毛纤孔菌三萜的体外降脂功能,为开发新型降血脂功能食品提供了实验依据。

登革病毒感染HepG2-严重联合免疫缺陷小鼠模型的建立

缺乏合适的动物模型严重限制了登革病毒(DENV)致病机制研究的进展。本研究旨在构建DENV感染小鼠模型,为阐明其致病机制提供实验材料。首先在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠腹腔内接种人肝癌细胞株HepG2,构建人鼠嵌合体动物模型;移植后10d腹腔接种DENV,通过检测病毒在体内分布及主要器官的组织学改变,评价该动物模型的实用价值。结果显示,在SCID小鼠成功移植HepG2并感染DENV后,出现病毒血症及主要器官严重损伤等现象,但无后肢麻痹等人类登革热无关症状。本研究成功构建了HepG2-SCID人鼠嵌合模型,该模型能支持DENV复制,并表现出部分人类DENV感染的临床症状,为研究DENV的致病机制提供了有价值的实验材料。

2型糖尿病双重缺陷

在“首届诺和诺德糖尿病论坛”召开一周年之际 ,诺和诺德公司于 2 0 0 3年 2月 12～ 14日在杭州再次召开了大型全国糖尿病专家研讨会。与会人员涉及全国 30余个省、市及自治区的 4 5 0余位糖尿病专家、医生。 2 0余位国内外专家在此作了精彩的演讲。会议紧紧围绕当今糖尿病研究领域的热点问题 ,尤其是对胰岛 β细胞功能受损在 2型糖尿病发病中的作用机制 ,β细胞功能的评估及检测 ,保护 β细胞功能的措施 ,控制高血糖及外源性胰岛素的使用等方面进行了深入细致的研讨。以下全文刊出了国内外 16位著名专家在此次“论坛”会上的专题报告 ,及“诺和诺德”公司的新产品简介 ,全面报道了本次“论坛”会的内容。

HepG2-hNTCP细胞模型的构建及在miRNA-548ah调控乙型肝炎病毒研究中的应用

目的构建并鉴定表达人钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(hNTCP)的HepG2-hNTCP细胞模型,探讨微小RNA-548ah(miR-548ah)对乙型肝炎病毒复制和表达的影响。方法扩增重组慢病毒pWPI-hNTCP-Puro质粒,pWPI-hNTCP-Puro慢病毒感染HepG2细胞,聚合酶链反应(PCR)检测hNTCPmRNA的表达水平,共聚焦显微镜检测hNTCP蛋白定位。Lipofectamine转染miR-548ah激动剂、miR-548ah抑制剂及阴性对照至细胞系。酶联免疫吸附测定检测HBsAg和HBeAg的表达水平,荧光定量PCR检测HBVDNA的表达,应用SPSS 17.0对数据进行分析。结果hNTCP mRNA在HepG2hNTCP呈高水平表达。共聚焦荧光显微镜观察HepG2hNTCP中的hNTCP蛋白正常表达且主要定位在细胞膜上。与HepG2细胞比较,HBsAg和HBeAg在感染后HepG2-hNTCP细胞5天和7天后的表达水平存在差异,随培养天数呈上升趋势,具有统计学意义(P<0.01)。与转染阴性对照比较,HBsAg在转染miR-548ah激动剂组的表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05);而HBeAg和HBVDNA的表达水平无明显变化,差异均无统计学意义。结论成功构建了表达hNTCP的HepG2-hNTCP细胞模型,对乙型肝炎病毒感染具有良好的易感性;miR-548ah可促进HBV感染HepG2-hNTCP细胞模型中HBsAg的表达。

荔枝核提取物及其阳离子树脂分离物体外降血糖作用

研究荔枝核乙醇提取物(LSE)和其阳离子树脂分离物(FCE)体外降血糖作用。采用高糖和高胰岛素所致的两种HepG2细胞模型,在模型培养中添加不同浓度的LSE与FCE,以葡萄糖试剂盒测定,MTT法等进行对HepG2细胞葡萄糖消耗作用的研究。结果表明:在高糖环境下,LSE和FCE均能促进HepG2细胞的葡萄糖消耗,而FCE的促进作用显著高于相近浓度的LSE,提示离子交换树脂分离物贡献了荔枝核提取物的降糖作用;此外,FCE还可与低剂量胰岛素协同增加细胞的葡萄糖消耗。在胰岛素抵抗模型中,FCE能显著降低胰岛素抵抗,增加细胞的葡萄糖消耗。荔枝核提取物和其阳离子树脂分离物具有体外降血糖作用。

滇西18种豆科植物体外降脂活性研究

目的:研究滇西18种豆科植物的体外降脂活性,为发现植物来源的新型降脂天然产物奠定基础。方法:利用75%乙醇对18种豆科植物进行热回流提取;采用高脂HepG2细胞模型对各植物提取物进行体外降脂活性筛选,通过降脂率对其活性进行评价。结果:13种植物提取物具有不同程度的降脂活性,其中云南甘草地上部分、截叶铁扫帚全株、黑毛多枝黄芪地下部分、鞍叶羊蹄甲地上部分提取物的降脂活性较好,终浓度为0.5 mg/mL时的降脂率分别为(21.6±3.9)%、(19.6±10.0)%、(17.8±1.9)%、(15.3±4.6)%。结论:云南甘草地上部分、截叶铁扫帚全株、黑毛多枝黄芪地下部分、鞍叶羊蹄甲地上部分具有较好的降脂活性,值得后续深入研究。

滇西33种菊科植物体外降脂活性研究

目的:研究滇西33种菊科植物的体外降脂活性,为发现植物来源的新型降脂天然产物奠定基础。方法:利用75%乙醇对33种菊科植物进行回流提取,采用人肝癌细胞HepG2高脂模型测定各植物提取物的体外降脂活性,以降脂率对其活性结果进行评价。结果:24种菊科植物提取物具有不同程度的体外降脂活性,其中熊胆草、紫茎泽兰、狼杷草及肿柄菊提取物体外降脂活性显著,终浓度为0.5 mg/mL时,降脂率分别为(18.4±1.9)%、(18.4±9.7)%、(17.5±10.2)%、(15.1±13.4)%,此4种菊科植物提取物与辛伐他汀体外降脂率比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:熊胆草、紫茎泽兰、狼杷草、肿柄菊4种植物具有显著的体外降脂活性,值得后续深入研究。

黑木耳多糖结构分析及其保护肝细胞氧化损伤活性

为确定黑木耳多糖的结构特征及其体外保护肝细胞氧化损伤活性,通过破壁提取法、Sevag法、透析法对黑木耳子实体多糖(AHP)进行了分离纯化,采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)、离子色谱(IC)和红外光谱(IR)法对黑木耳多糖进行了分子质量、单糖组成及特征官能团分析;建立肝细胞氧化损伤模型,对AHP的肝保护活性进行了研究。结果表明:AHP糖含量为83.879%,分子质量410.3 kD,主要由岩藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)按2.240∶0.692∶3.994∶22.754∶65.696摩尔比组成的β型吡喃糖。H2O2损伤人肝癌细胞HepG2细胞中加入AHP后发现,AHP可抑制受损细胞发生的细胞核皱缩和边缘羽化现象;提高损伤细胞的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶活性;减少一氧化氮(NO)等氧化产物生成量。AHP具有保护肝细胞氧化损伤的活性,具有将其进一步开发为保肝健康食品的潜力。

人源化肝细胞共培养系统为基础的代谢活化系统研究

目的从不同组合的人源化肝细胞系共培养模型中构建并筛选优势共培养体系,为人源化代谢活化系统在遗传毒性和致突变性中的应用提供理论基础。方法以HepG2/C3A人源肝癌细胞作为代谢活化系统的支持细胞,应用穿孔法对HepG2/C3A、LX-2肝星形细胞和Caco-2人源肠腺癌细胞三细胞进行不同组合的共培养模型的构建和筛选,CCK-8法测定模型中每个细胞的4 d生长曲线以确定能稳定生长的共培养模型,RT-qPCR测定在不同类型培养模型中HepG2/C3A细胞CYP3A4、CYP2E1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、GSTA1/2和UGT1A1基因的表达情况。结果由HepG2/C3A-Caco2-LX2细胞构建的三细胞共培养(COL)模型中各细胞生长状态稳定。RT-qPCR结果显示在不同的共培养模型中,肝细胞的Ⅰ相及Ⅱ相代谢酶基因的表达差异较大,COL模型中HepG2/C3A细胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4、UGT1A1和GSTA1/2基因表达水平分别是单培养组的3.41、4.20、2.88、4.75和5.11倍,差异有统计学意义(P<0.05)。双细胞共培养模型中HepG2/C3A-Caco2(CO-C)和HepG2/C3A-LX2(CL)的肝细胞仅CYP2E1或GSTA1/2相对单培养组表达略有升高,差异有统计学意义(P<0.05),CYP3A4、CYP1A2、CYP2B6和UGT1A1基因的表达水平均有所降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论不同细胞共培养模型对肝细胞的Ⅰ相及Ⅱ相代谢酶基因的表达产生较大影响,相比本研究中的双细胞共培养体系,HepG2/C3A-Caco2-LX2三细胞共培养体系可更稳定的生长,且主要的Ⅰ相及Ⅱ相代谢酶基因表达水平明显升高,有望作为代谢活化系统的优势共培养体系。

lncRNA LAMA5-AS1在胰岛素抵抗中的作用及黄芪多糖与小檗碱联合使用对其的调控机制

目的:探讨黄芪多糖(AP)与小檗碱(BBR)联合使用对胰岛素抵抗(IR)HepG2细胞模型的作用是否通过调控长链非编码RNA(lncRNA)LAMA5-AS1的表达。方法:建立IR HepG2细胞模型并给予AP-BBR干预,构建LAMA5-AS1过表达载体和siRNA,检测其过表达效果和干扰效果。将LAMA5-AS1和LAMA5-AS1 siRNA分别转染HepG2细胞,采用qRT-PCR检测IR相关基因mRNA表达;RNA pull-down和RNA免疫沉淀法(RIP)分别检测LAMA5-AS1和PCB蛋白之间的相互作用和结合情况。结果:与对照组比较,模型组LAMA5-AS1表达显著升高(P<0.05),AP-BBR组可显著降低LAMA5-AS1的表达(P<0.05)。与IR组比较,IR+AP-BBR组、IR+OE+AP-BBR组和IR+OENC+AP-BBR组chemerin、GLUT2、PPARα和PPARγ mRNA水平显著升高(P<0.01);IR+AP-BBR组、IR+siRNA+AP-BBR组和IR+siNC+AP-BBR组中chemerin、GLUT2、myostatin、p38MAPK和PPARα mRNA水平显著升高(P<0.01,P<0.05);IR+siRNA组chemerin、GLUT2、myostatin、p38MAPK、PPARα和PPARγ mRNA水平显著升高(P<0.01,P<0.05)。RNA pull-down和RIP实验发现,IP较IgG有显著的富集趋势(P<0.01),推断LAMA5-AS1-202可与PCB蛋白结合。结论:lncRNA LAMA5-AS1作为上游基因可诱导IR的发生,AP-BBR可能通过抑制LAMA5-AS1的表达,增加胰岛素相关基因水平而改善IR。

紫色红曲霉色素与食药同源中药联合降脂作用

为探究紫色红曲霉色素与食药同源降脂中药(TCM)联用协同降血脂的可能性,进一步丰富红曲色素的降脂特性,为新型降血脂功能食品的制备奠定理论基础,从红曲中分离到一株不产Monacolin K的紫色红曲霉,经发酵条件优化后提取红曲色素,并测定红曲色素的体外抗氧化性;同时在传统降脂方中挑选合适的食药同源降脂中药进行新型降脂方复配,并通过HepG2细胞试验测定红曲色素与中药联用时对细胞总胆固醇(TC)和总甘油三酯(TG)含量及脂质代谢相关基因表达的影响.结果表明,红曲色素具有良好的体外抗氧化活性,对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除率分别为88.1%、47.7%和37.5%.红曲色素与中药联用时对细胞内TC和TG含量的降低分别达到62%和66%,大于中药组(对TC和TG的降低分别为49%和57%)与色素组(对TC和TG的降低分别为7%和3%)两者降脂之和,说明红曲色素与中药联用在降血脂上具有协同作用.本研究表明红曲色素与中药联用制备新型降脂功能食品具有可行性,该结果可为高脂血症的治疗提供更多的选择.

玳玳果黄酮提取物关键效应组分辨识及调控脂质代谢作用机制研究

目的 探究玳玳果黄酮提取物及其敲出目标组分对脂肪变性细胞调控脂质代谢作用及机制,辨识关键效应组分。方法 采用油酸诱导建立HepG2脂肪变性细胞模型,非诺贝特为阳性对照,油红O染色法及甘油三酯(triglycerides,TG)和总胆固醇(totalcholesterol,TC)为评价指标,考察玳玳果黄酮提取物、柚皮苷(目标组分)、新橙皮苷(目标组分)、其他相关组分(黄酮提取物敲除柚皮苷、新橙皮苷)、黄酮提取物敲除其他相关组分(柚皮苷-新橙皮苷6︰7)对脂肪变性模型细胞脂质集聚影响。基于AMPK/SREBP-1c及PPARα信号通路,采用qRT-PCR法、Western blotting检测大鼠肝脏相关基因、蛋白的表达。结果 预防性给药后,与模型组相比,玳玳果黄酮提取物、柚皮苷、新橙皮苷、提取物敲除其他相关组分的细胞脂质积聚、TG及TC含量均有明显的改善(P<0.01或P<0.05);玳玳果黄酮提取物及柚皮苷、新橙皮苷可使促腺苷酸激活蛋白激酶(ATP-activated protein kinase,AMPK)的mRNA及磷酸化蛋白表达水平明显升高(P<0.01或P<0.05);显著抑制并明显下调固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding protein,SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、乙酰辅酶羧化酶(coenzymecarboxylase,ACC)的mRNA和蛋白表达水平(P<0.01或P<0.05);可促进过氧化物酶增殖物激活受体(peroxidaseproliferator-activatedreceptor, PPARα)、肉毒碱棕榈酰基转移酶(carnitine palmitoyltransferase-1,CPT-l)的mRNA及蛋白表达水平明显上升(P<0.01或P<0.05);其他相关组分无明显差异。结论 玳玳果黄酮提取物及其关键效应组分柚皮苷、新橙皮苷可有效改善脂质积聚;其作用机制为激活AMPK促其蛋白磷酸化表达,从而抑制脂质合成,同时促进脂肪酸的氧化分解,由此减少脂肪沉积,发挥调控脂质代谢的作用。