在HepG2细胞系上建立四环素(Tet-On)基因调控系统表达P4502E1(英文)

目的 在HepG2细胞系上建立四环素 (Tet On)基因调控系统 ,调控表达P4 5 0 2E1(CYP2E1)。 方法 先后转导调控蛋白基因及CYP2E1cDNA(已与四环素反应启动子整合 )入HepG2细胞。用多西环素调控CYP2E1的表达 ,用RT PCR和Westernblot检测其表达高低。结果 RT PCR和Westernblot均检测出CYP2E1被多西环素调控表达。结论 四环素 (Tet On)基因调控系统 (表达CYP2E1)已在HepG2细胞系上成功建立。

表达绵羊肺腺瘤病毒跨膜蛋白HepG2细胞系的建立

为深入研究绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)与绵羊肺腺瘤病(OPA)发病关系,本研究采用PCR方法从pGEX-4T-1-TM重组质粒中扩增编码JSRV跨膜蛋白(TM)的基因序列,并引入标签多肽HA序列和限制性内切酶位点,将其重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组质粒pcDNA-TM-HA。通过转染HepG2细胞并用G418筛选,对稳定表达TM的阳性细胞进行纯化,获得了稳定表达JSRV tm基因的HepG2细胞系。间接免疫荧光及western blot检测结果表明,重组蛋白TM-HA在HepG2细胞中得到正确表达。JSRV TM蛋白稳定表达细胞系的建立为进一步研究该蛋白与JSRV诱导OPA发病关系提供了重要的实验平台。

tTS真核表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系的建立

为了构建tTS真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系,采用PCR方法,以质粒pTet-tTS为模板扩增tTS基因的编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pApoE-rtTA-Neo,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用RT-PCR、Western blot法检年测tTS的表达,成功构建了pApoE-rtTA-tTS-Neo真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的基因。真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究tTS的功能奠定良好的实验基础。

外源性甲胎蛋白对甲胎蛋白表达缺失HepG2细胞系增殖与凋亡的影响

目的:观察不同浓度外源性甲胎蛋白(AFP)对AFPsiRNA-HepG2细胞系(AFP表达缺失HepG2细胞系)的增殖与凋亡的影响。方法:体外培养AFPsiRNA-HepG2细胞,将细胞分为对照组,100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml AFP 6组,MTT法检测细胞增殖;Annexin V-APC/7-AAD染色、流式细胞术检测细胞凋亡百分比。结果:MTT结果提示,与阴性对照组比较,100μg/ml AFP组显著抑制细胞增殖(P<0.01),低于100μg/mlAFP组促进细胞增殖(P<0.05);流式细胞术结果提示,与阴性对照组比较,100μg/ml AFP组显著诱导细胞凋亡(P<0.01),低于100μg/ml AFP干预组对细胞凋亡无影响(P>0.05)。结论:低于100μg/ml AFP可促进细胞增殖,高于100μg/ml AFP可显著抑制细胞增殖,并诱导其发生凋亡。

正肝方药物血清对甲胎蛋白刺激的AFPsiRNA HepG2细胞系凋亡的影响

目的:观察正肝方药物血清对甲胎蛋白(AFP)刺激的AFPsiRNA HepG2细胞凋亡的影响。方法:正肝方浸膏粉经灌胃给药制备正肝方大鼠血清。体外培养AFPsiRNA HepG2细胞,将细胞分为5%正常大鼠血清组、5%正肝方大鼠血清组、10%正常大鼠血清组、10%正肝方大鼠血清组、5%正常大鼠血清+AFP组、5%正肝方血清+AFP组、10%正常大鼠血清+AFP组、10%正肝方大鼠血清+AFP组共8组,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:无AFP刺激时,正肝方大鼠血清与正常大鼠血清对HepG2细胞凋亡相比较,差异无显著性意义(P>0.05);当有AFP刺激时,正肝方血清与正常大鼠血清对细胞凋亡相比较,差异有显著性意义(P<0.01)。结论:正肝方大鼠血清能显著诱导AFPsiRNA HepG2细胞凋亡。其机制是通过影响AFP介导的肝癌细胞凋亡通路来实现的。

和枢消积方对人肝癌细胞系HepG2增殖凋亡的影响

目的探讨和枢消积方对人肝癌细胞系HepG2增殖凋亡的影响,揭示可能的分子机制。方法使用和枢消积方作用于人肝癌细胞系HepG2,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)、平板克隆实验检测细胞增殖能力。采用蛋白质印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2基因(BCL-2)、BCL-2相关X蛋白(BAX)、丙型肝炎病毒(HCV)非结构5A蛋白(NS5A)反式激活基因13(NS5ATP13)及蛋白激酶B(AKT)/糖原合酶激酶(GSK)/雷帕霉素靶蛋白(MTOR)相关通路蛋白的表达水平。结果和对照组相比,和枢消积方各组可使HepG2细胞活性、增殖率显著降低(P<0.05);同时可上调BAX的蛋白表达,下调BCL-2及磷酸(p)-AKT、p-GSK、p-MTOR及NS5ATP13的表达(P<0.05),呈浓度依赖性。结论和枢消积方可以抑制HepG2细胞的增殖并诱导凋亡,这可能与和枢消积方抑制NS5ATP13的表达,继而抑制AKT/GSK/MTOR信号转导通路的活化有关。

MMP2和MMP9在HepG2肝癌细胞系及HCC组织中表达的比较研究

目的分析MMP2和MMP9在HepG2细胞系及肝细胞癌(HCC)组织中的表达,探讨不同的基质金属蛋白酶(MMPs)与肝细胞癌侵袭转移的特异相关性。方法免疫细胞化学检测HepG2细胞系中MMP2和MMP9的表达,免疫组织化学检测38例HCC肝癌组织中MMP2和MMP9的表达。结果MMP9在HepG2细胞系的表达高于MMP2的表达。MMP9和MMP2在HCC组织中均有所表达,但MMP9的表达率84.2%(32/38)明显高于MMP2的表达52.6%(20/38),二者有显著差异(P<0.05)。结论MMP2、MMP9的表达在体内外呈现出一致性,即MMP9在体内外的表达均高于MMP2,推测可能MMP9与HCC的侵袭转移关系更为密切。

人肝癌细胞系HepG2在遗传毒物检测中的应用及其进展

外来化合物的体外遗传毒性实验常用于各种致癌物和致突变物的快速筛选.HepG2是一种分化好的人肝胚细胞瘤细胞系,保留了较完整的代谢酶及其活性.以HepG2细胞作为实验系统检测各种致癌及非致癌物,在多个观察终点均获得相应的阳性及阴性结果.

肝癌多药耐药细胞系HepG2/ADM的建立及耐药机制研究

目的建立人肝癌多药耐药细胞系并研究其耐药特性及机制。方法应用人肝癌细胞株HepG2,采用阿霉素(ADM)浓度梯度递增诱导法,建立多药耐药细胞系HepG2/ADM。相差显微镜观察细胞,用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,采用流式细胞术检测该耐药细胞表面多药耐药基因(mdr)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH/GST)的表达情况,应用RT-PCR检测MDR、MRP基因表达水平。结果HepG2/ADM对多种抗癌药物产生耐药,对阿霉素的耐药性提高了89.38倍。流式细胞仪分析发现(45.5±5.1)%的HepG2/ADM细胞表面P-gp表达阳性,而对照细胞HepG2表达仅为(11.3±1.2)%,二者差异有显著性(P<0.01);HepG2/ADM和HepG2细胞的MRP及GSH/GST表达无明显变化(P>0.05)。RT-PCR检测发现HepG2/ADM中MDR mRNA高表达。结论HepG2/ADM具有明确的多药耐药性,其多药耐药相关基因MDR mRNA表达升高。

p100蛋白慢病毒干扰载体及p100沉默的HepG2稳定细胞系的构建

目的:用表达shRNA的干扰慢病毒载体系统构建p100基因稳定沉默的HepG2人肝癌细胞系。方法:通过RNAi序列设计软件进行p100干扰片段设计,筛选出p100基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的OligoDNA并构建pLKO.3G-p100I慢病毒载体,用双酶切及测序进行鉴定。将构建好的p100shRNA表达质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293T,包装产生病毒颗粒。运用病毒颗粒感染HepG2细胞,获得p100稳定沉默的细胞系。荧光显微镜下观察感染效率,利用Westernblot方法检测稳定细胞株中p100的沉默效果。结果:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒载体,并获得了稳定沉默p100及对照的HepG2细胞株。慢病毒感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到90%以上细胞发出绿色荧光,Westernblot证实干扰p100后,HepG2细胞株中p100蛋白表达水平明显降低。结论:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒干扰载体及p100稳定沉默的HepG2细胞系。

ANXA2、VEGF对HepG2肝癌细胞系转移的促进作用

目的:探讨膜联蛋白2(ANXA2)、血管内皮生长因子(VEGF)促进HepG2肝癌细胞系转移的作用.方法:应用Transwell、RT-PCR、Western blot,检测在不同5-氟尿嘧啶(5-FU)剂量(50、100、200、400mg/L)干扰下,ANXA2、VEGF的表达及其促进HepG2肝癌细胞系转移的作用.结果:Transwell方法检测HepG2肝癌细胞随着5-FU剂量的增加侵袭力较对照组明显降低,各剂量组间差异具有明显统计学意义(22±5,25±4,13±2,12±2vs39±7,均P<0.05);RT-PCR、Westernblot方法检测HepG2肝癌细胞中ANXA2、VEGFmRNA、蛋白的表达量随着5-FU剂量的增加逐渐下降,与对照组间的差异具有显著统计学意义(ANXA2mRNA:0.527±0.008,0.419±0.046,0.213±0.007,0.176±0.007vs0.718±0.008;ANXA2蛋白:0.669±0.055,0.484±0.072,0.180±0.034,0.099±0.009vs1.236±0.102;VEGFmRNA:0.818±0.016,0.558±0.101,0.386±0.009,0.352±0.017vs1.176±0.035;VEGF蛋白:0.960±0.085,0.962±0.056,0.376±0.069,0.219±0.008vs1.124±0.170,均P=0.000),且两者具有相关性(rp=0.900,rw=0.856).结论:随着5-FU剂量的逐渐增加,HepG2肝癌细胞侵袭率及ANXA2、VEGF表达量逐渐下降,两者呈显著正相关,提示两者在肝癌细胞的侵袭转移机制中可能起重要作用.

MCFP慢病毒干涉载体及HepG2稳定细胞系的构建

目的:研究线粒体转运蛋白质超家族新成员SLC25A40(MCFP)RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体对人肝癌细胞系HepG2细胞中MCFP基因的沉默效果.方法:通过RNAi序列设计软件进行MCFP干涉片段设计,筛选出MCFP基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的OligoDNA,构建pSiCoR-MCFP慢病毒载体并包装产生慢病毒干涉毒液.运用病毒感染HepG2细胞获得稳定干涉MCFP的细胞株,利用PCR和Westernblot方法检测稳定细胞株中MCFP的干涉效果.结果:成功构建具有MCFP干涉效果的慢病毒干涉载体并获得了稳定干涉MCFP及对照的HepG2细胞株.收集慢病毒上清,流式测定干涉病毒滴度为1.45×1010pfu/L,对照病毒滴度为1.78×1010pfu/L.PCR和Westernblot实验均证实干涉MCFP后,HepG2细胞株中MCFP蛋白表达水平明显降低(P<0.001).结论:成功构建具有MCFP干涉效果的慢病毒干涉载体及稳定干涉MCFP的HepG2细胞株.

幽门螺杆菌改变人肝细胞系HepG2蛋白质表达谱

目的研究H.pylori作用后肝细胞系HepG2蛋白质表达谱的改变,通过对差异蛋白质点的鉴定与分析,以探讨H.pylori对肝细胞的病理作用。方法采用体外肝细胞和H.pylori共培养,应用双向凝胶电泳分离H.pylori处理前后细胞总蛋白,筛选出差异表达的蛋白质点,并进行质谱分析鉴定。结果鉴定出7种表达上调的蛋白质点,包括整合素-β1、蛋白激酶C-α、LIM同源盒蛋白Lhx1、真核翻译起始因子2-β亚单位、PINCH蛋白、MAPK激酶3、Ras相关蛋白Rab-37等。这些蛋白质参与了基因表达调控、细胞免疫、细胞生长、信号传导等众多事件。结论H.pylori可能通过介导这些蛋白质的上调而发挥对HepG2细胞的病理作用。这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究H.pylori与人类肝胆疾病的关系。

过氧化氢诱导同步化HepG2细胞DNA损伤和凋亡的敏感时相研究

目的 :探讨过氧化氢 (H2 O2 )诱导HepG2细胞的DNA损伤和凋亡效应在细胞周期不同时相的敏感性 .方法 :利用胸腺嘧啶核苷 (TdR)阻断肝癌HepG2细胞于G1期末后 ,去除胸苷 ,培养不同时间 ,分别得到同步化的G1期、S期和G2 /M期细胞 ,1 5 0 μmol/L的H2 O2 处理 1 2h ,采用单细胞凝胶电泳技术 (SCGE)测定细胞的DNA损伤 ;将各期细胞用2 0 0 μmol/L的H2 O2 处理 ,采用流式细胞术测定细胞凋亡 .同时实验设立未同步化和正常对照组 .结果 :①分别获得88.6 %的G1期细胞、78.1 %的S期细胞、6 6 .8%的G2 /M期细胞 .②SCGE结果显示 ,同步化于S期和G2 /M期细胞的DNA尾长明显增长 ,尾部DNA百分比含量和尾矩明显增加 ,其中S期细胞效应最为显著 .③凋亡检测结果显示 ,同步化各组细胞的凋亡率明显高于未同步化组 ,以S期最为显著 .结论 :H2 O2 诱导HepG2细胞DNA损伤和细胞凋亡在细胞周期的不同时相效应敏感性不同 。

齐墩果酸和绿原酸对HepG2细胞及P450酶的影响

目的观察齐墩果酸和绿原酸对HepG2细胞增殖、周期变化及CYP相关基因表达的影响。方法以利福平为对照,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、流式细胞术、实时定量PCR技术检测,测定不同质量浓度齐墩果酸、绿原酸的作用。结果齐墩果酸、绿原酸对HepG2细胞增殖有明显抑制作用,阻滞HepG2细胞停留于S期。齐墩果酸和利福平均能诱导CYP1A1和CYP3A4表达。绿原酸抑制CYP1A1和CYP3A4表达。结论齐墩果酸、绿原酸均能影响细胞周期来抑制HepG2细胞生长,并显示不同质量浓度对CYP1A1、CYP3A4 mRNA的表达影响不一致。

过氧化物酶V基因沉默HepG2肝癌细胞系的构建及鉴定

过氧化物酶V(Peroxiredoxin V,Prx V)是过氧化物酶家族(Peroxiredoxins)中的一员,具有清除细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)从而抑制由于氧化应激导致的细胞凋亡的作用。该研究通过慢病毒载体构建Prx V基因沉默的HepG2肝癌稳定细胞系。采用荧光照相及蛋白免疫印迹法对其结果进行鉴定,为研究Prx V的功能提供良好的基础。结果表明:成功构建Prx V基因沉默的HepG2肝癌细胞系。

旋毛虫排泄分泌蛋白对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用

采用MTT法检测旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对人肝癌Hep G2细胞增殖的抑制作用。AO/EB荧光染色观察与300μg/ml排泄分泌蛋白共培养24 h的Hep G2细胞的细胞核形态。用75μg/ml排泄分泌蛋白作用Hep G2细胞24 h后,流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡率,免疫荧光法检测细胞cleaved-caspase 9的表达。结果显示,旋毛虫排泄分泌蛋白呈剂量依赖性抑制人肝癌Hep G2细胞的增殖。300μg/ml排泄分泌蛋白作用24 h后,Hep G2细胞核固缩呈圆珠状凋亡特征。75μg/ml排泄分泌蛋白作用细胞24 h后,细胞早期和晚期凋亡率分别为17.9%和7.3%,细胞坏死占6.6%;Hep G2细胞中cleaved-caspase 9荧光强度明显高于阴性对照。

人肝癌HepG2细胞超微弱发光的观察

目的:探讨人肝癌HepG2细胞系超微弱发光的特征。方法:用IFFM-D型流动式化学发光仪检测人肝细胞株QZG及人肝癌HepG2细胞系超微弱发光的强度以及不同浓度鲁米诺(Lum inol)和双氧水(H2O2)对其超微弱发光的影响。结果:在10-4mol/L鲁米诺及0.3%双氧水条件下,人肝癌HepG2细胞超微弱发光强度明显高于人肝细胞株QZG(P<0.05),并随细胞浓度增高其超微弱发光强度呈线性增高,其差异显著(P<0.05);提高鲁米诺浓度为10-3mol/L时,人肝癌HepG2细胞发光强度明显增加(P<0.05);提高双氧水浓度为3%时,其超微弱发光强度的变化无显著差异(P>0.05)。结论:人肝癌HepG2细胞的超微弱发光强度明显高于人肝细胞株QZG,细胞浓度及鲁米诺、双氧水浓度变化能影响细胞超微弱发光强度。超微弱发光反映了肿瘤细胞的功能状态,检测肿瘤细胞超微弱发光强度可作为一项敏感的肿瘤细胞生理及代谢指标。

微小RNA miR-199a／a^＊模拟物转染肝癌细胞HepG2中Met原癌基因的表达

目的探讨在肝癌细胞系HepG2中,Met是否为miR-199a/a*的靶基因。方法将miR-199a/a*的模拟物及阴性对照物分别转染至HepG2细胞中,转染后48 h及72 h分别提取RNA及蛋白行RT-PCR及Western Blot检测Met的表达。结果与阴性对照相比,转染Up-miR-199a*组的Met mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.001)表达水平均显著下调;而Up-miR-199a组与阴性对照组相比无统计学差异。结论肝癌细胞HepG2中miR-199a*负调控Met的mRNA及蛋白表达。

培养HepG2细胞的几点体会

ＨｅｐＧ２细胞系是一种不易培养的用于ＨＢＶ研究的肝癌细胞。本文通过调整某些培养条件，提高了ＨｅｐＧ２细胞的增殖速率，同时也降低了细胞的培养成本，为ＨＢＶ的研究提供了方便的受体细胞。