粗毛纤孔菌三萜成分分析及其对HepG 2细胞模型的脂质调节作用

为探索粗毛纤孔菌中的总三萜活性成分及其体外降脂能力,采用超高液相色谱-飞行时间质谱联用技术(UPLC-TOF-MS/MS)对粗毛纤孔菌中的总三萜进行定性分析,并通过油酸诱导建立HepG_(2)细胞高脂模型,以HepG_(2)细胞高脂模型的存活率、脂质积累量和血脂四项为指标,考察粗毛纤孔菌纯化后总三萜的体外降脂能力。根据UPLC-TOF-MS/MS得到的洗脱顺序、保留时间、分子量、质谱信息,结合文献,共鉴定出粗毛纤孔菌中三萜成分8种。体外实验表明,400μmol/L油酸孵育HepG_(2)细胞24 h时,HepG_(2)细胞内的脂质积累量最高。相较于其他浓度组,总三萜质量浓度为250μg/mL时,高脂HepG_(2)细胞内的脂质含量下降最为显著,总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇的清除率分别达到41.86%、44.44%、44.02%,高密度脂蛋白胆固醇的增长率达到57.33%。研究结果证实了粗毛纤孔菌三萜的体外降脂功能,为开发新型降血脂功能食品提供了实验依据。

HepG2-hNTCP细胞模型的构建及在miRNA-548ah调控乙型肝炎病毒研究中的应用

目的构建并鉴定表达人钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(hNTCP)的HepG2-hNTCP细胞模型,探讨微小RNA-548ah(miR-548ah)对乙型肝炎病毒复制和表达的影响。方法扩增重组慢病毒pWPI-hNTCP-Puro质粒,pWPI-hNTCP-Puro慢病毒感染HepG2细胞,聚合酶链反应(PCR)检测hNTCPmRNA的表达水平,共聚焦显微镜检测hNTCP蛋白定位。Lipofectamine转染miR-548ah激动剂、miR-548ah抑制剂及阴性对照至细胞系。酶联免疫吸附测定检测HBsAg和HBeAg的表达水平,荧光定量PCR检测HBVDNA的表达,应用SPSS 17.0对数据进行分析。结果hNTCP mRNA在HepG2hNTCP呈高水平表达。共聚焦荧光显微镜观察HepG2hNTCP中的hNTCP蛋白正常表达且主要定位在细胞膜上。与HepG2细胞比较,HBsAg和HBeAg在感染后HepG2-hNTCP细胞5天和7天后的表达水平存在差异,随培养天数呈上升趋势,具有统计学意义(P<0.01)。与转染阴性对照比较,HBsAg在转染miR-548ah激动剂组的表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05);而HBeAg和HBVDNA的表达水平无明显变化,差异均无统计学意义。结论成功构建了表达hNTCP的HepG2-hNTCP细胞模型,对乙型肝炎病毒感染具有良好的易感性;miR-548ah可促进HBV感染HepG2-hNTCP细胞模型中HBsAg的表达。

HepG2细胞胰岛素抵抗模型建立及盐酸小檗碱改善胰岛素抵抗的实验研究

目的建立HepG2(人肝胚胎瘤细胞)胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)细胞模型,并在该模型上研究小檗碱改善IR的效应。方法用25 mmol·L^(-1)高糖,并分别用10^(-9)、10^(-8)、10^(-7)、10^(-6)、10^(-5)、10^(-4)mol·L^(-1)胰岛素处理,诱导HepG2细胞产生IR;对2-NBDG(荧光素标记葡萄糖)与Hep G2细胞孵育浓度设定为:50、100、200、400、600、800μmol·L^(-1)、孵育时间设定为:20、40、60、80、100 min,拟筛选最佳胰岛素处理浓度、2-NBDG与HepG2最佳孵育浓度和最佳孵育时间,通过检测细胞培养液中葡萄糖的消耗量及细胞对葡萄糖的摄取量作为判定模型成功的标志;用二甲双胍、盐酸小檗碱干预模型细胞,研究盐酸小檗碱在细胞水平上改善IR的效应。结果 6种浓度的胰岛素均可不同程度诱导HepG2产生IR,虽然10^(-5)、10^(-4)mol·L^(-1)剂量最明显,但细胞死亡较多,以10-6mol·L^(-1)剂量制模有效且细胞成活率高,与正常组比较差异具有统计学意义;当2-NBDG与HepG2细胞孵育浓度大于100μmol·L^(-1)时,细胞荧光强度与正常组差异有显著性,孵育时间超过20 min荧光强度与正常组比较有明显差异,超过100 min,细胞内荧光有明显淬灭衰减现象;盐酸小檗碱、二甲双胍能明显增加细胞培养上清液中葡萄糖的消耗及细胞对葡萄糖的摄取,与模型组比较差异具有统计学意义。结论用HepG2制作IR细胞模型时,选择10^(-6)mol·L^(-1)剂量的胰岛素;2-NBDG孵育浓度选择为200μmol·L^(-1)、2-NBDG孵育时间选择为80min较为适宜,盐酸小檗碱及二甲双胍对HepG2细胞IR具有明显的改善作用。

吡格列酮对胰岛素抵抗HepG2细胞模型的药理学评价

目的应用高胰岛素诱导培养HepG2细胞，建立胰岛素抵抗的细胞模型。并探讨吡格列酮对该模型胰岛素敏感性和糖代谢的影响。方法将HepG2细胞置于5×10～mol·L^-1胰岛素培养液中16h，采用^3H-D-葡萄糖参入试验观察高胰岛素对HepG2细胞葡萄糖摄取率的影响。模型建立后，培养液中加入吡格列酮共同孵育，观察吡格列酮对胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖摄取率和葡萄糖消耗量的影响。结果高胰岛素诱导培养的HepG2细胞葡萄糖参入率明显低于未用高胰岛素诱导的HepG2细胞（对照细胞）。将高胰岛素诱导培养的HepG2细胞置于不含胰岛素的培养液中60h，其细胞葡萄糖摄取率仍明显低于对照细胞。含有吡格列酮（浓度为1×10^-6～1×10^-4mol·L^-1）的胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖参入率与葡萄糖消耗量明显高于不含吡格列酮的胰岛素抵抗HepG2细胞（P〈0．01）。结论将HepG2置于5×10^-7mol·L^-1胰岛素环境中16h，该细胞对胰岛素的生物学效应产生抵抗，其胰岛素抵抗状态可维持60h。该方法较为简便、易行、重复性好、成功率高，可广泛用于胰岛素抵抗的研究。吡格列酮能增加胰岛素抵抗模型细胞的胰岛素敏感性，并能明显改善糖代谢。

地塞米松诱导的胰岛素抵抗HepG2细胞模型的建立及鉴定

目的体外用地塞米松诱导培养法建立及鉴定肝胰岛素抵抗细胞模型。方法将HepG2细胞置于含不同浓度地塞米松培养基中培养24 h,用含胰岛素的新鲜培养基刺激24 h,采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(glucose oxidase-peroxide enzyme,GOD-POD)法检测细胞对葡萄糖的消耗情况,蒽酮法检测细胞内糖原含量,利用Western blot检测细胞内胰岛素受体底物-2表达的变化。结果用地塞米松处理HepG2细胞24 h后,细胞对胰岛素的敏感性显著降低,1.0、3.3、10.0μmol/L地塞米松组葡萄糖消耗分别为(0.637±0.018)、(0.535±0.018)、(0.471±0.011)mmol/L(P<0.05,P<0.01),细胞内糖原含量分别为(2.83±0.13)、(2.42±0.10)、(2.23±0.06)μmol/mg(P<0.05,P<0.01),胰岛素受体底物-2表达量均下降(P<0.05,P<0.01)。结论体外地塞米松诱导培养法可以成功建立肝胰岛素抵抗细胞模型,此细胞模型出现胰岛素抵抗的机制可能与IRS-2表达的下调有关。

过氧化氢诱导HepG2细胞产生氧化应激细胞模型的建立

不同浓度过氧化氢作用人肝癌细胞(HepG2)4h后,用单细胞凝胶电泳技术测定DNA损伤状况,分光光度法测定丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,研究过氧化氢的最佳作用浓度,构建体外氧化应激细胞模型。结果表明,过氧化氢的最佳作用浓度为100μmol/L,作用细胞的时间选择4h,可以成功构建以过氧化氢为氧化应激诱导剂的HepG2细胞体外氧化应激模型。

胰岛素耐受的HepG2细胞模型建立

采用高胰岛素体外诱导培养HepG2细胞,建立胰岛素耐受的细胞模型。将HepG2细胞置于5×10-7mol/L胰岛素培养液中24h,采用3H-D-葡萄糖掺入试验及残余125I-胰岛素结合率测定等方法观察高胰岛素对HepG2细胞葡萄糖摄取率及其胰岛素受体数目和功能的影响。高胰岛素诱导培养的HepG2细胞葡萄糖掺入率及残余125I-胰岛素结合率明显低于未用高胰岛素诱导的HepG2细胞(对照细胞)。将高胰岛素诱导培养的HepG2细胞置于不含胰岛素的培养液中60h,其细胞葡萄糖摄取率仍明显低于对照细胞。将HepG2细胞置于5×10-7mol/L胰岛素环境中24h,该细胞对胰岛素的生物学效应产生抵抗,其胰岛素抵抗状态可维持60h。

紫色马铃薯花色苷改善HepG2细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的机制

目的:观察紫色马铃薯花色苷对HepG2细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的作用并对其机制进行初探。方法:以高浓度葡萄糖培养基为诱导因素诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗细胞模型,通过葡萄糖氧化酶法、四唑盐比色实验(MTT)和蛋白质印迹法(Western blot)检测紫色马铃薯花色苷对胰岛素抵抗细胞模型的葡萄糖消耗量、细胞存活率和胰岛素信号通路的蛋白表达的影响。结果:与空白对照组相比,当诱导培养基中葡萄糖浓度为50 mmol/L时吸光度的差值最大,所以选50 mmol/L的葡萄糖培养基来建立胰岛素抵抗细胞模型;花色苷的处理胰岛素抵抗细胞的浓度为40~100μg/mL时,葡萄糖消耗量可高达19.55 mmol/L显著(p<0.05)高于模型对照组;花色苷浓度为40~100μg/mL时细胞存活率基本上可以保持在80%,细胞毒性较小;花色苷可以调节因高浓度葡萄糖诱导而导致的IR、IRS-1、IRS-2水平下降的情况,降低p-IRS-1的表达水平,还可以阻止GLUT-2水平的降低。结论:紫色马铃薯花色苷可以改善HepG2细胞胰岛素抵抗模型的胰岛素信号通路抑制的情况,改善胰岛素抵抗模型的糖代谢。

采用HepG_2细胞株建立裸鼠肝癌模型的方法

目的 :探讨采用HepG2 细胞株建立裸鼠肝癌模型的方法。方法 :采用皮下注射HepG2 细胞 (1 2× 1 0 6)建立裸鼠肝癌模型 ,观察种植细胞后 1 4天内裸鼠的死亡率 ,并在 1 4天时活杀动物测定瘤体重量、直径及血清AFP浓度。结果 :该法造模成功率达 1 0 0 %。结论 :该方法操作简便 ,周期短 。

丙型肝炎病毒体外感染HepG2细胞模型的建立

目的:建立近似自然感染的丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)体外感染细胞模型。方法:将含10%HCVRNA阳性血清的接种液和HepG2细胞在37℃、5%CO2条件下共同孵育24h,再加含新生牛血清、地塞米松、胰岛素及硫酸亚铁的维持培养液,置32℃、5%CO2条件下培养,以后每3～4d传代一次,定期收集培养上清液和细胞。应用RT鄄nested鄄PCR、免疫组化及Westernblot进行病毒核酸和蛋白质的检测。结果:RT鄄nested鄄PCR法检测发现在接种病毒后第4～16天的细胞标本中可检测到HCVRNA正链,接种病毒后第4～24天的细胞标本则可检测到HCVRNA副链。通过免疫组化和Westernblot检测,病毒蛋白(NS3)能在第4天检出。结论:HCV体外感染HepG2细胞模型的建立,可望用于HCV吸附肝细胞机制研究及疫苗中和试验。

基于HepG2细胞模型研究普洱茶茶色素的抗氧化作用

采用正常培养和油酸诱导培养的HepG2细胞为模型,通过测定普洱茶茶色素对HepG2细胞外谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,过氧化氢酶(catalase,CAT)活力和细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影响,以研究普洱茶茶色素的抗氧化作用。结果显示,普洱茶茶色素对正常培养的HepG2细胞的抗氧化作用影响不显著,而对油酸诱导的HepG2细胞模型抗氧化作用有显著的提高。抗氧化作用提高的程度依赖于普洱茶茶色素的质量浓度。当400μg/m L普洱茶茶色素作用HepG2油酸诱导模型24 h,细胞外GSH含量由0.004 4 g/L增加到0.010 3g/L,CAT活力由0.136 U/m L提高至1.174 U/m L,细胞内MDA含量由15.146 nmol/mg减少到7.635 nmol/mg,从而使这些指标接近正常培养HepG2细胞模型水平。因此,普洱茶茶色素的抗氧化作用是通过提高清除活性氧的酶活力和促进合成还原性物质来干预细胞的氧化应激。

HepG2细胞线粒体毒性评价模型的建立及应用

目的：近些年来，因线粒体相关的药物毒副作用引起的上市药物撤市或终止在临床前／期的新药研发屡见不鲜，因此，药源性线粒体损伤已引起广大医药界的重视。如何更加有效、快捷地评价药源性线粒体损伤成为新药研发工作人员的重要任务。本文针对肝脏线粒体毒性问题以人源化HepG2肝细胞分别建立以葡萄糖和半乳糖作为生长碳源的线粒体毒性评价模型，并对目前临床上出现线粒体毒性的核苷类似物类药物进行评价。

过氧化氢诱导HepG2细胞氧化应激模型的建立

建立过氧化氢(H_2O_2)介导的HepG2细胞氧化应激模型,为筛选抗氧化活性物质以及揭示抗氧化应激机制提供细胞学模型。采用不同浓度H_2O_2处理Hep G2细胞不同时间,噻唑蓝(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)法检测细胞存活率,二氯荧光黄双乙酸盐(2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)法检测活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,分光光度法检测丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,以及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catlase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)活性。结果表明,随着H_2O_2浓度升高和作用时间延长,Hep G2细胞存活率降低,ROS水平和MDA含量升高,SOD、CAT和GSH-Px活性降低。与对照组相比,200μmol/L H_2O_22处理Hep G2细胞6 h,细胞存活率显著降低(P<0.05),仅为63.1%;ROS水平和MDA含量显著升高(P<0.05),分别为127.1%和135.1%;SOD、CAT和GSH-Px活性显著降低(P<0.05),分别为77.28%、78.56%和77.41%。H_2O_2诱导HepG2细胞建立氧化应激模型的最佳条件为H_2O_2作用浓度200μmol/L,作用时间6 h。

乙型肝炎病毒感染HepG2细胞模型的构建

目的:构建乙型肝炎病毒(HBV)感染的细胞模型。方法:将携带1.2拷贝HBV基因的重组腺病毒感染HEK293细胞进行包装、扩增并分离纯化。将扩增得到的HBV感染HepG2细胞,用ELISA法检测感染后第4天培养上清中的HBsAg,Real-time RT-PCR检测HBV mRNA。结果:ELISA检测结果显示,HepG2细胞感染HBV后上清液中HBsAg呈阳性。Real-time RT-PCR可以检测到HBV mRNA。结论:HBV能在HepG2细胞中表达复制和表达,HBV感染的HepG2细胞模型构建成功。

对乙酰氨基酚诱导HepG2细胞氧化应激损伤模型的构建

目的建立以对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)诱导的HepG2细胞氧化应激损伤模型。方法噻唑蓝〔MTT〕法检测HepG2细胞活力;微板法检测细胞培养液中天门冬氨酸氨基转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)的含量,细胞中超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)活性;利用荧光探针(DCFH-DA)法对HepG2细胞内活性氧的水平(ROS)进行检测;JC-1染色法检测不同浓度APAP对HepG2细胞线粒体膜电位的影响;Hoechst染色观察细胞凋亡情况。结果随着APAP处理时间和浓度增加,HepG2细胞相对活力明显降低,细胞数量减少,并伴随着皱缩、变圆甚至漂浮等形态学变化;细胞培养液中的ALT、AST和LDH含量显著升高,而细胞中的CAT和SOD活性明显下降;另外,胞内ROS水平和线粒体膜电位发生显著变化,细胞凋亡显著增加。诱导Hep G2细胞产生氧化应激损伤模型最佳条件为APAP浓度30mmol·L-1,细胞作用时间12h。结论本研究构建了APAP体外氧化应激细胞损伤模型,为保肝活性药物筛选及其作用机制研究提供细胞学模型。

HepG2细胞胰岛素抵抗模型建立影响因素研究

目的建立体外肝癌(HepG2)细胞胰岛素抵抗(IR)模型,研究血清添加、诱导剂浓度和培养时间对模型建立的影响。方法采用不同浓度胰岛素对肝癌HepG2细胞进行不同时间的诱导,建立肝细胞IR模型;以葡萄糖氧化酶法研究不同诱导浓度、培养时间及血清添加对胰岛素抵抗模型细胞葡萄糖消耗量(ΔGC)的影响。采用噻唑蓝(MTT)法评价细胞活性,并计算葡萄糖比消耗率(ΔGC/R),得到最佳建模条件。结果适当提高胰岛素诱导浓度可缩短诱导时间,或可通过延长诱导时间来降低诱导浓度。胰岛素能促进HepG2细胞增殖,且在含血清培养基中增殖较迅速。诱导后的细胞在含血清培养基中培养24 h即能得到理想的胰岛素抵抗模型。结论可通过胰岛素诱导培养法建立稳定的IR模型,在含5×10^(-8) mol/L胰岛素的培养基中诱导48 h,再换含血清培养基继续培养24 h,易形成明显的胰岛素抵抗模型。此HepG2细胞模型在较长时间内(72 h)均可维持胰岛素抵抗特性。

HepG2胰岛素抵抗细胞模型的诱导及其在生物活性评价中的应用

胰岛素抵抗是一种多因素诱发和多基因调控疾病。为了阐明胰岛素抵抗产生的机制,国内外学者建立了多种胰岛素抵抗细胞模型,其中HepG2肝癌细胞是应用较多的细胞模型。本文就HepG2肝癌细胞胰岛素抵抗模型的诱导方法及其在生物活性评价中的应用进行综述,以期为外周靶组织的胰岛素抵抗研究提供一定的理论参考。

胰岛素抵抗HepG2细胞模型建立的正交实验研究

目的探索联合应用胰岛素(INS)、棕榈酸(PA)和高糖建立HepG2细胞胰岛素抵抗(IR)模型的最佳实验方法。方法单因素考察INS、PA浓度及孵育时间对HepG2细胞增殖活性的影响;正交实验确定建立HepG2细胞IR模型的最佳条件。蒽酮法检测细胞糖原含量,油红O染色观察细胞形态变化。结果影响HepG2细胞葡萄糖消耗的主次因素顺序为:孵育时间>PA>INS,10 μmol·L-1 PA联合1.0 μmol·L-1 INS的高糖培养基孵育HepG2细胞48 h,葡萄糖消耗减少了22.36%。模型组细胞糖原合成较对照组显著减少,细胞脂肪颗粒明显增加。模型细胞IR作用可持续存在48 h,但24 h时作用最强。结论高糖培养基联合小剂量PA和INS,较长时间作用于HepG2细胞建立的IR模型,稳定可靠,重复性好,接近人体IR的病理生理状态,为防治IR药物筛选及发病机制研究奠定基础。

葫芦巴碱对HepG2细胞胰岛素抵抗的影响

目的:探讨葫芦巴碱对HepG2细胞胰岛素抵抗的影响。方法:培养HepG2细胞,MTT法检测葫芦巴碱对HepG2细胞增殖的影响以确定可作用于HepG2细胞的葫芦巴碱的浓度;将HepG2细胞置于含胰岛素浓度为1×10^(-6)mol/L的培养液中,培养36 h成功建立胰岛素抵抗模型后,每孔加入100μL不同浓度的含药培养基,用葡萄糖检测试剂盒检测葫芦巴碱对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响。结果:葫芦巴碱浓度为3,000、2,500、2,000、1,500、1,000、500μmol/L时的细胞存活率分别为21.38%、39.23%、51.43%、73.36%、86.23%、91.88%,葫芦巴碱浓度>1,000μmol/L时对细胞有明显的毒性,故选择终浓度为1,000、500、250、100、50、25μmol/L进行实验,各浓度葫芦巴碱对胰岛素抵抗的HepG2细胞的葡萄糖消耗分别为(4.679±0.04)、(3.994±0.062)、(3.683±0.094)、(3.633±0.120)、(3.619±0.119)、(3.503±0.128)μmol/L,其中,前两个浓度与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:葫芦巴碱对HepG2细胞胰岛素抵抗有改善作用。