和枢消积方对人肝癌细胞系HepG2增殖凋亡的影响

目的探讨和枢消积方对人肝癌细胞系HepG2增殖凋亡的影响,揭示可能的分子机制。方法使用和枢消积方作用于人肝癌细胞系HepG2,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)、平板克隆实验检测细胞增殖能力。采用蛋白质印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2基因(BCL-2)、BCL-2相关X蛋白(BAX)、丙型肝炎病毒(HCV)非结构5A蛋白(NS5A)反式激活基因13(NS5ATP13)及蛋白激酶B(AKT)/糖原合酶激酶(GSK)/雷帕霉素靶蛋白(MTOR)相关通路蛋白的表达水平。结果和对照组相比,和枢消积方各组可使HepG2细胞活性、增殖率显著降低(P<0.05);同时可上调BAX的蛋白表达,下调BCL-2及磷酸(p)-AKT、p-GSK、p-MTOR及NS5ATP13的表达(P<0.05),呈浓度依赖性。结论和枢消积方可以抑制HepG2细胞的增殖并诱导凋亡,这可能与和枢消积方抑制NS5ATP13的表达,继而抑制AKT/GSK/MTOR信号转导通路的活化有关。

幽门螺杆菌对肝细胞系HepG2 cyclinD1,PCNA mRNA表达的影响

目的:研究幽门螺杆菌(H pylori)处理对肝细胞系HepG2 cyclinD1,PCNA mRNA表达的影响. 方法:将H pylori与HepG2共同培养1 h、3 h、6 h、12 h 和24 h,采用半定量RT-PCR方法分析共培养不同时间后HepG2 cyclinD1,PCNA mRNA的表达水平. 结果:CagA+ H pylori与HepG2细胞共同孵育1 h后,即可见cyclinD1 mRNA表达升高,3h达高峰,约为对照的4.0倍(P<0.01);共同孵育3 h后即可见PCNA mRNA表达升高,6 h达高峰,约为对照的2.0倍(P<0.05).而CagA- H pylori 和HepG2细胞共同孵育后,未见两基因的表达升高. 结论:CagA+ H pylori能诱导HepG2 cyclinD1,PCNA mRNA表达升高,提示其在肝癌的发生中起一定作用.

MMP2和MMP9在HepG2肝癌细胞系及HCC组织中表达的比较研究

目的分析MMP2和MMP9在HepG2细胞系及肝细胞癌(HCC)组织中的表达,探讨不同的基质金属蛋白酶(MMPs)与肝细胞癌侵袭转移的特异相关性。方法免疫细胞化学检测HepG2细胞系中MMP2和MMP9的表达,免疫组织化学检测38例HCC肝癌组织中MMP2和MMP9的表达。结果MMP9在HepG2细胞系的表达高于MMP2的表达。MMP9和MMP2在HCC组织中均有所表达,但MMP9的表达率84.2%(32/38)明显高于MMP2的表达52.6%(20/38),二者有显著差异(P<0.05)。结论MMP2、MMP9的表达在体内外呈现出一致性,即MMP9在体内外的表达均高于MMP2,推测可能MMP9与HCC的侵袭转移关系更为密切。

人肝癌细胞系HepG2在遗传毒物检测中的应用及其进展

外来化合物的体外遗传毒性实验常用于各种致癌物和致突变物的快速筛选.HepG2是一种分化好的人肝胚细胞瘤细胞系,保留了较完整的代谢酶及其活性.以HepG2细胞作为实验系统检测各种致癌及非致癌物,在多个观察终点均获得相应的阳性及阴性结果.

肝癌细胞系HepG2细胞周期与端粒酶活性及HBV复制的关系

背景与目的:大量研究表明端粒酶活性与肿瘤细胞的发生、发展密切相关,而且乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)复制、端粒酶活性高低与细胞周期亦存在相关性。为进一步证实其内在联系,本实验探讨无血清培养、全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid,RA)对HBVDNA转染的人肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响以及细胞周期与端粒酶活性、HBV复制状态的关系。方法:分别用RA、无血清培养处理HepG2细胞并与对照组比较。细胞周期用流式细胞仪测定,端粒酶活性用TRAP-PCR-ELISA定量检测,HBVDNA分别用荧光PCR定量检测及斑点杂交半定量检测,HBsAg和HBeAg用ELISA方法定量检测。结果:RA、无血清培养使HepG2细胞生长受抑制,停滞在G0/G1期(RA组、无血清培养组G0/G1期时相百分比分别为68.3%、65.2%),端粒酶活性明显下降(RA组、无血清培养组代表端粒酶活性的吸光度A值分别为0.32、0.41),与对照组(G0/G1期时相百分比为43.1%,代表端粒酶活性吸光度A值为1.34)相比,两者之间有显著性差异(P<0.01);细胞培养液中HBVDNA、HBsAg和HBeAg含量显著增加(RA组分别为4.4×106copies/ml、3.5、19.8;无血清培养组分别为5.1×106copies/ml、3.7、22.5),与对照组(分别为1.2×106copies/ml、1.3、13.4)相比,两者之间有显著性差异(P<0.01)。结论:端粒?

肝癌多药耐药细胞系HepG2/ADM的建立及耐药机制研究

目的建立人肝癌多药耐药细胞系并研究其耐药特性及机制。方法应用人肝癌细胞株HepG2,采用阿霉素(ADM)浓度梯度递增诱导法,建立多药耐药细胞系HepG2/ADM。相差显微镜观察细胞,用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,采用流式细胞术检测该耐药细胞表面多药耐药基因(mdr)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH/GST)的表达情况,应用RT-PCR检测MDR、MRP基因表达水平。结果HepG2/ADM对多种抗癌药物产生耐药,对阿霉素的耐药性提高了89.38倍。流式细胞仪分析发现(45.5±5.1)%的HepG2/ADM细胞表面P-gp表达阳性,而对照细胞HepG2表达仅为(11.3±1.2)%,二者差异有显著性(P<0.01);HepG2/ADM和HepG2细胞的MRP及GSH/GST表达无明显变化(P>0.05)。RT-PCR检测发现HepG2/ADM中MDR mRNA高表达。结论HepG2/ADM具有明确的多药耐药性,其多药耐药相关基因MDR mRNA表达升高。

ANXA2、VEGF对HepG2肝癌细胞系转移的促进作用

目的:探讨膜联蛋白2(ANXA2)、血管内皮生长因子(VEGF)促进HepG2肝癌细胞系转移的作用.方法:应用Transwell、RT-PCR、Western blot,检测在不同5-氟尿嘧啶(5-FU)剂量(50、100、200、400mg/L)干扰下,ANXA2、VEGF的表达及其促进HepG2肝癌细胞系转移的作用.结果:Transwell方法检测HepG2肝癌细胞随着5-FU剂量的增加侵袭力较对照组明显降低,各剂量组间差异具有明显统计学意义(22±5,25±4,13±2,12±2vs39±7,均P<0.05);RT-PCR、Westernblot方法检测HepG2肝癌细胞中ANXA2、VEGFmRNA、蛋白的表达量随着5-FU剂量的增加逐渐下降,与对照组间的差异具有显著统计学意义(ANXA2mRNA:0.527±0.008,0.419±0.046,0.213±0.007,0.176±0.007vs0.718±0.008;ANXA2蛋白:0.669±0.055,0.484±0.072,0.180±0.034,0.099±0.009vs1.236±0.102;VEGFmRNA:0.818±0.016,0.558±0.101,0.386±0.009,0.352±0.017vs1.176±0.035;VEGF蛋白:0.960±0.085,0.962±0.056,0.376±0.069,0.219±0.008vs1.124±0.170,均P=0.000),且两者具有相关性(rp=0.900,rw=0.856).结论:随着5-FU剂量的逐渐增加,HepG2肝癌细胞侵袭率及ANXA2、VEGF表达量逐渐下降,两者呈显著正相关,提示两者在肝癌细胞的侵袭转移机制中可能起重要作用.

在HepG2细胞系上建立四环素(Tet-On)基因调控系统表达P4502E1(英文)

目的 在HepG2细胞系上建立四环素 (Tet On)基因调控系统 ,调控表达P4 5 0 2E1(CYP2E1)。 方法 先后转导调控蛋白基因及CYP2E1cDNA(已与四环素反应启动子整合 )入HepG2细胞。用多西环素调控CYP2E1的表达 ,用RT PCR和Westernblot检测其表达高低。结果 RT PCR和Westernblot均检测出CYP2E1被多西环素调控表达。结论 四环素 (Tet On)基因调控系统 (表达CYP2E1)已在HepG2细胞系上成功建立。

表达绵羊肺腺瘤病毒跨膜蛋白HepG2细胞系的建立

为深入研究绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)与绵羊肺腺瘤病(OPA)发病关系,本研究采用PCR方法从pGEX-4T-1-TM重组质粒中扩增编码JSRV跨膜蛋白(TM)的基因序列,并引入标签多肽HA序列和限制性内切酶位点,将其重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组质粒pcDNA-TM-HA。通过转染HepG2细胞并用G418筛选,对稳定表达TM的阳性细胞进行纯化,获得了稳定表达JSRV tm基因的HepG2细胞系。间接免疫荧光及western blot检测结果表明,重组蛋白TM-HA在HepG2细胞中得到正确表达。JSRV TM蛋白稳定表达细胞系的建立为进一步研究该蛋白与JSRV诱导OPA发病关系提供了重要的实验平台。

tTS真核表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系的建立

为了构建tTS真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系,采用PCR方法,以质粒pTet-tTS为模板扩增tTS基因的编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pApoE-rtTA-Neo,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用RT-PCR、Western blot法检年测tTS的表达,成功构建了pApoE-rtTA-tTS-Neo真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的基因。真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究tTS的功能奠定良好的实验基础。

肝癌细胞系(HepG2)感染HCV RNA的研究

为建立丙型肝炎病毒 (HCV )体外感染和细胞培养系统 ,用定量的 HCV RNA阳性血清感染人肝癌细胞系 (Hep G2细胞系 ) ,应用地高辛标记 HCV RNA探针原位杂交技术和 RT- PCR方法对感染后的细胞和上清液中的 HCV RNA进行了检测。在感染后的第一代至第七代的细胞中出现特异性杂交阳性信号 ,第一代、第二代和第六代检测出 HCV RNA正链 ,并在感染后第一、二代检测出 HCV RNA负链。显示 HCV不仅能在体外感染 Hep G2细胞系 ,而且有基因的复制 ,证明 Hep G2细胞能作为 HCV的体外细胞培养系。

幽门螺杆菌对人肝细胞系HepG2细胞蛋白质组的影响

目的:初步观察H pylori对人肝细胞系HepG2蛋白质的差异表达,为进一步探讨H pylori对细胞的病理作用机制奠定基础. 方法:将H pylori与HepG2共同培养6 h,采用双向电泳技术,对H pylori处理和未处理HepG2细胞蛋白质进行分离和比较分析. 结果:图像分析探H pylori处理前后HepG2 2-DE图谱的平均蛋白质点数分别为988±94个、996±68个,蛋白质点的匹配率为86.4%.发现对照和H pylori处理HepG2 蛋白表达有明显差异,主要是蛋白表达量的增加和减少, 其中在H pylori处理后有10种蛋白(Mr/pI:91 326/6.21, 90 640/6.68,87 833/5.65,81 139/6.55,63 805/6.24, 60 445/7.38,47 592/5.28,46 293/7.21,43 415/7.64, 21 704/5.66)表达增强,8种蛋白(Mr/pI:70 839/7.02, 56 403/6.58,44 076/6.86,43 744/7.21,42 497/6.64, 37 567/7.17,22 342/7.49,21 112/5.63)表达降低. 结论:H pylori处理前后HepG2的蛋白质组具有差异,这些差异表达的蛋白质可能参与了H pylori对肝细胞的病理作用过程,这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究H pylori与人类肝脏疾病的关系.

MCFP慢病毒干涉载体及HepG2稳定细胞系的构建

目的:研究线粒体转运蛋白质超家族新成员SLC25A40(MCFP)RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体对人肝癌细胞系HepG2细胞中MCFP基因的沉默效果.方法:通过RNAi序列设计软件进行MCFP干涉片段设计,筛选出MCFP基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的OligoDNA,构建pSiCoR-MCFP慢病毒载体并包装产生慢病毒干涉毒液.运用病毒感染HepG2细胞获得稳定干涉MCFP的细胞株,利用PCR和Westernblot方法检测稳定细胞株中MCFP的干涉效果.结果:成功构建具有MCFP干涉效果的慢病毒干涉载体并获得了稳定干涉MCFP及对照的HepG2细胞株.收集慢病毒上清,流式测定干涉病毒滴度为1.45×1010pfu/L,对照病毒滴度为1.78×1010pfu/L.PCR和Westernblot实验均证实干涉MCFP后,HepG2细胞株中MCFP蛋白表达水平明显降低(P<0.001).结论:成功构建具有MCFP干涉效果的慢病毒干涉载体及稳定干涉MCFP的HepG2细胞株.

外源性甲胎蛋白对甲胎蛋白表达缺失HepG2细胞系增殖与凋亡的影响

目的:观察不同浓度外源性甲胎蛋白(AFP)对AFPsiRNA-HepG2细胞系(AFP表达缺失HepG2细胞系)的增殖与凋亡的影响。方法:体外培养AFPsiRNA-HepG2细胞,将细胞分为对照组,100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml AFP 6组,MTT法检测细胞增殖;Annexin V-APC/7-AAD染色、流式细胞术检测细胞凋亡百分比。结果:MTT结果提示,与阴性对照组比较,100μg/ml AFP组显著抑制细胞增殖(P<0.01),低于100μg/mlAFP组促进细胞增殖(P<0.05);流式细胞术结果提示,与阴性对照组比较,100μg/ml AFP组显著诱导细胞凋亡(P<0.01),低于100μg/ml AFP干预组对细胞凋亡无影响(P>0.05)。结论:低于100μg/ml AFP可促进细胞增殖,高于100μg/ml AFP可显著抑制细胞增殖,并诱导其发生凋亡。

幽门螺杆菌改变人肝细胞系HepG2蛋白质表达谱

目的研究H.pylori作用后肝细胞系HepG2蛋白质表达谱的改变,通过对差异蛋白质点的鉴定与分析,以探讨H.pylori对肝细胞的病理作用。方法采用体外肝细胞和H.pylori共培养,应用双向凝胶电泳分离H.pylori处理前后细胞总蛋白,筛选出差异表达的蛋白质点,并进行质谱分析鉴定。结果鉴定出7种表达上调的蛋白质点,包括整合素-β1、蛋白激酶C-α、LIM同源盒蛋白Lhx1、真核翻译起始因子2-β亚单位、PINCH蛋白、MAPK激酶3、Ras相关蛋白Rab-37等。这些蛋白质参与了基因表达调控、细胞免疫、细胞生长、信号传导等众多事件。结论H.pylori可能通过介导这些蛋白质的上调而发挥对HepG2细胞的病理作用。这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究H.pylori与人类肝胆疾病的关系。

p100蛋白慢病毒干扰载体及p100沉默的HepG2稳定细胞系的构建

目的:用表达shRNA的干扰慢病毒载体系统构建p100基因稳定沉默的HepG2人肝癌细胞系。方法:通过RNAi序列设计软件进行p100干扰片段设计,筛选出p100基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的OligoDNA并构建pLKO.3G-p100I慢病毒载体,用双酶切及测序进行鉴定。将构建好的p100shRNA表达质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293T,包装产生病毒颗粒。运用病毒颗粒感染HepG2细胞,获得p100稳定沉默的细胞系。荧光显微镜下观察感染效率,利用Westernblot方法检测稳定细胞株中p100的沉默效果。结果:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒载体,并获得了稳定沉默p100及对照的HepG2细胞株。慢病毒感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到90%以上细胞发出绿色荧光,Westernblot证实干扰p100后,HepG2细胞株中p100蛋白表达水平明显降低。结论:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒干扰载体及p100稳定沉默的HepG2细胞系。

过氧化物酶V基因沉默HepG2肝癌细胞系的构建及鉴定

过氧化物酶V(Peroxiredoxin V,Prx V)是过氧化物酶家族(Peroxiredoxins)中的一员,具有清除细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)从而抑制由于氧化应激导致的细胞凋亡的作用。该研究通过慢病毒载体构建Prx V基因沉默的HepG2肝癌稳定细胞系。采用荧光照相及蛋白免疫印迹法对其结果进行鉴定,为研究Prx V的功能提供良好的基础。结果表明:成功构建Prx V基因沉默的HepG2肝癌细胞系。

正肝方药物血清对甲胎蛋白刺激的AFPsiRNA HepG2细胞系凋亡的影响

目的:观察正肝方药物血清对甲胎蛋白(AFP)刺激的AFPsiRNA HepG2细胞凋亡的影响。方法:正肝方浸膏粉经灌胃给药制备正肝方大鼠血清。体外培养AFPsiRNA HepG2细胞,将细胞分为5%正常大鼠血清组、5%正肝方大鼠血清组、10%正常大鼠血清组、10%正肝方大鼠血清组、5%正常大鼠血清+AFP组、5%正肝方血清+AFP组、10%正常大鼠血清+AFP组、10%正肝方大鼠血清+AFP组共8组,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:无AFP刺激时,正肝方大鼠血清与正常大鼠血清对HepG2细胞凋亡相比较,差异无显著性意义(P>0.05);当有AFP刺激时,正肝方血清与正常大鼠血清对细胞凋亡相比较,差异有显著性意义(P<0.01)。结论:正肝方大鼠血清能显著诱导AFPsiRNA HepG2细胞凋亡。其机制是通过影响AFP介导的肝癌细胞凋亡通路来实现的。

沉默PrxⅡ基因促进巨噬细胞对肝癌细胞的杀伤作用

为探究PrxⅡ对RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞系)细胞杀伤HepG2(人肝癌细胞系)细胞的影响,阐明PrxⅡ基因调控RAW264.7细胞分泌细胞因子杀伤HepG2细胞的作用,利用慢病毒干扰技术制备PrxⅡ基因沉默的RAW264.7细胞系、MTT assay测定HepG2细胞存活情况、ELISA法测定RAW264.7细胞分泌炎性因子情况、蛋白质免疫印迹法检测NF-κB信号通路相关蛋白质表达水平。结果表明:已成功制备PrxⅡ基因沉默的RAW264.7细胞系;MTT检测发现RAW264.7细胞上清液处理HepG2细胞后,shPrxⅡ组HepG2细胞存活率明显低于mock组,且呈时间依赖性;ELISA结果表明shPrxⅡ组RAW264.7细胞分泌的TNF-α含量明显高于mock组,IL-6和IL-1β含量明显低于mock组;蛋白质免疫印迹结果与mock组相比,PrxⅡ基因沉默的RAW264.7细胞中NF-κB信号通路明显被激活。由此得出结论,PrxⅡ基因能调控RAW264.7细胞分泌细胞因子,杀伤HepG2细胞,导致HepG2细胞死亡水平上升,研究结果可为以巨噬细胞为靶点的免疫疗法提供理论基础,为肝癌患者的免疫治疗提供新思路。

血卟啉单甲醚对人肝细胞癌细胞系HepG_2的光动力杀伤效应

目的光动力治疗是一种有效的局部肿瘤治疗手段。包括光敏剂的注射及激光照射两部分;观察以HMME作为光敏剂,再辅以630 nm二极管激光照射对人肝细胞癌细胞HepG2的光动力杀伤效应。方法应用MTT技术来检测HepG2细胞的抑制率;