甘草甜素对HepG2.2.15细胞株HBV感染的影响

目的探讨甘草甜素(GL)对HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的作用,及对细胞存活率的影响。方法实时荧光定量PCR检测HBV DNA的表达,ELASA检测HBV所分泌抗原,MTT检测细胞的增殖活性,计算细胞存活率。结果给药后各组HBsAg分泌结果显示总体均数间差异显著(P=0.000),GL各组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),抑制作用存在剂量依赖关系;而对HBeAg水平的影响因剂量不同而表现为升高和降低两种趋势,除50μg/mL组外,其余各组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),但800μg/mL组HBeAg分泌增加,400μg/mL以下组为HBeAg降低;HBV DNA的表达显示GL各组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),但400μg/mL以下组为HBV DNA降低,800μg/mL组出现HBV DNA复制增强;MTT实验显示,200μg/mL以下3个剂量组均可促进细胞增殖(P<0.01),400、800μg/mL2组均显著抑制细胞增殖(P<0.01);MTT分别与HBeAg和HBV DNA水平呈显著负相关(P<0.01),但与HBsAg呈显著正相关(r=0.869,P=0.000)。结论GL对HepG2.2.15细胞株上清中的HBeAg和HBV DNA水平可能具有双向作用,而对HBsAg具有剂量依赖的抑制作用,提示GL的使用应注意选择适应证及合适的剂量。

乙型肝炎病毒转染及脂多糖刺激对HepG2细胞Toll样受体2和4表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)转染对HepG2细胞表面Toll样受体(TLR)表达的影响及脂多糖(LPS)加重HBV转染致肝细胞损伤是否存在直接作用,进一步探讨乙型肝炎发病及重型化的发生机制。方法以不同浓度的LPS刺激HepG2细胞、HepG2．2．15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞),并以免疫细胞化学方法检测HepG2细胞及HepG2．2．15细胞表面TLR 2、4蛋白质表达情况,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLR2、4 mRNA表达情况,用Abbot试剂检测HepG2．2．15细胞HgsAg和HgeAg表达情况,用流式细胞仪观察细胞生长周期及细胞凋亡情况。结果HepG2、HepG2．2．15细胞膜上均有TLR2、4蛋白质表达,免疫细胞化学染色在未加LPS及各浓度LPS刺激细胞均可见细胞膜有棕褐色着色,且随着LPS浓度增加,其着色强度增加;对0mg/L及10mg/L LPS诱导HepG2、HepG2．2．15细胞RNA进行RT-PCR扩增,其产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳均可见特异性条带,且10mg/L LPS诱导细胞TLR2和TLR4与分子量标准品的吸光度值比值明显高于0mg/L LPS诱导细胞扩增产物,分别为306．63±6．18对519．84±9．15和700．54±13．56对1116．62±37．67,F值分别为740．58和426．07,P值分别为0．01和0．02;流式细胞仪检测细胞周期发现HepG2绌胞及未经LPS诱导的HepG2．2．15未发生凋亡,各浓度LPS诱导的HepG2．2．15细胞均有细胞凋亡发生,且细胞凋亡率随着LPS浓度增加上升。结论LPS可能通过其与肝细胞膜上的TLR结合,而参与HBV转染后肝细胞损害及肝脏炎症重型化的发病机制。

人源抗-HBs轻链与干扰素-α融合蛋白的克隆及表达

目的构建人源单克隆抗-HBs Fab片段-IFN-α表达载体,对原核表达该融合蛋白的可行性及其效果进行实验研究。方法用聚合酶链反应(PCR)体外扩增目的基因IFN-α,单酶点插入已含人源抗-HBs Fab基因的载体,插入点位于轻链基因3′末端,利用酶切、PCR鉴定,测序筛选正确插入的阳性克隆,转化大肠埃希菌Top10,挑选单克隆表达、纯化目的蛋白,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测融合蛋白的抗原性,用Dot-blot和WISH细胞检测其生物学活性。结果利用插入了人源抗-HBs Fab段基因及IFN-α基因的pBAD/gⅢA原核表达系统,成功表达了具生物活性的轻链与IFN-α的融合蛋白,其与HBsAg的亲合力与抗-HBs-Fab相近,而且具有干扰素的活性。融合蛋白对HepG2.2.15细胞初步实验结果亦显示出其具有良好的靶向性及致凋亡作用。结论轻链与干扰素IFN-α融合蛋白的成功表达表明,应用原核系统能够同时表达特异抗体和其介导的某些生物活性因子,不失为一种经济、有效的方法,为特异抗体及其介导融合蛋白的制备和临床应用提供了实验依据。